與肝纖維化相關的長鏈非編碼RNA的研究進展

胡存梁，陳尼維

(上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院，上海 200233)

肝纖維化是肝臟組織損傷后修復失調的結果，其病理特征是細胞外基質過度沉積[1～3]。各種原因所致的慢性肝損傷，導致肝星狀細胞(HSC)被活化并轉分化為肌成纖維樣細胞，分泌大量細胞外基質，包括α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原α1(COL1α1)，并釋放促炎因子和促纖維化因子[4～6]。其中轉化生長因子β1(TGF-β1)是主要的促纖維化因子，TGF-β-Smad信號通路是調控肝纖維化的重要細胞內信號通路，參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[7,8]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是指分子量大于200個核苷酸的RNA，能通過多種途徑調控基因表達，參與染色體重塑、轉錄及轉錄后等過程[9]。lncRNA表達異常參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其是在器官纖維化、腫瘤方面[10～14]。本文對lncRNA與肝纖維化關系的研究進展進行綜述。

1 促肝纖維化lncRNA

1.1 Alu介導的p21轉錄調節(jié)因子(APTR) p21基因位于染色體6p21.2，其編碼的蛋白p21是位于p53基因下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子，具有抑制細胞周期和細胞增殖的作用，而APTR內輔助元件Alu是APTR結合到p21所必須的。Yu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，APTR在人、小鼠纖維化肝組織以及活化的HSCs中表達上調。敲除APTR基因能夠抑制體外培養(yǎng)的HSC活化，且能減輕體內膠原蛋白(α-SMA、COL1α1)的堆積。另外，敲除APTR基因能夠增加HSC內p21表達，從而抑制細胞周期和細胞增殖，導入p21 siRNA1至HSC能夠減弱這一抑制作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，p21在肝纖維化模型中表達下調，且其表達隨APTR表達增加而下降，APTR能招募多梳抑制復合物2(PRC2)結合到p21啟動子，從而抑制p21表達，最終抑制HSC活化與增殖[16]。肝纖維化患者血清APTR水平升高，提示APTR是診斷和治療肝纖維化的潛在標志物。

1.2 由TGF-β激活的lncRNA(lncRNA-ATB) lncRNA-ATB是TGF-β信號通路的重要調節(jié)因子。在丙型肝炎病毒(HCV)相關肝纖維化患者的肝臟組織、血清及HSC中l(wèi)ncRNA-ATB水平均上調，敲除HSC中l(wèi)ncRNA-ATB基因能抑制HSC活化(α-SMA和COL1α1表達減少)[17,18]。lncRNA-ATB作為競爭性內源RNA(ceRNA)可促進HCV相關肝纖維化，作用機制主要包括以下幾點。首先，lncRNA-ATB能競爭性結合miR-425-5p，抑制miR-425-5p，進而在轉錄后水平抑制靶基因TGF-β RⅡ和SMAD2表達，激活TGF-β信號通路，最終使HSC活化和增殖[17]；其次，在HCV相關肝纖維化患者肝臟組織及活化的HSC中miR-200a表達下降、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)表達上調，當敲除lncRNA-ATB后，miR-200a表達上調、β-catenin表達下調，同時抑制人LX-2細胞(HSC細胞系)活化[18]。β-catenin是miR-200a的靶目標[19]，lncRNA-ATB作為ceRNA，與miR-200a結合使其不能抑制β-catenin表達，而β-catenin可促進細胞增殖和分化[20]。另外，HCV相關肝纖維化患者肝纖維化程度越嚴重，其血清lncRNA-ATB水平越高[17]。因此，lncRNA-ATB可能成為診斷和治療HCV相關肝纖維化的靶標。

1.3 HOX轉錄反義RNA(Hotair) Bian等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Hotair在小鼠肝纖維化模型、人纖維化肝臟組織、LX-2細胞中表達均顯著增加。上調LX-2細胞中Hotair表達可抑制人母系表達基因3(MEG3)表達，并且促進LX-2細胞的增殖和活化，而抑制其表達則作用相反。究其原因，一方面，Hotair通過與miR-148b競爭性結合，使miR-148b不能抑制其靶基因DNA轉甲基酶1(DNMT1)表達，導致DNMT1表達增加，DNMT1抑制MEG3、p53表達從而促進HSC增殖活化[22]。另一方面，Hotair能促進PRC2結合到MEG3啟動子上，抑制MEG3表達，最終增加HSC活性[21]。上述結果提示，Hotair抑制物可能抑制肝纖維化的發(fā)生。

1.4 肝癌細胞中上調的lncRNA(HULC) T細胞參與肝臟發(fā)生炎癥和纖維化的過程[23]。Zhao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，乙肝相關肝硬化患者血漿中調節(jié)T細胞(Tregs)和HULC顯著上調。通過慢病毒載體增加T細胞內HULC表達，能夠使Tregs/T細胞比值增加，表明HULC能促進T細胞分化。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HULC能夠直接下調周期蛋白依賴激酶抑制劑p18水平，p18能夠抑制T細胞增殖，p18基因丟失導致T細胞增殖增加。因此，HULC可能通過直接下調p18水平促進T細胞分化從而參與肝纖維化。

2 抗肝纖維化lncRNA

2.1 人母系表達基因3(MEG3) MEG3是一種印跡基因，位于14q32，該基因編碼的lncRNA與多種人類癌癥相關。He等[22]研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化時MEG3表達下降與其啟動子發(fā)生超甲基化密切相關。MEG3表達水平在小鼠肝纖維化模型、人纖維化肝臟組織及LX-2細胞中均顯著減少。對活化的LX-2細胞轉染甲基化抑制劑5-azad C或小干擾RNA(siRNA)到DNMT1基因，抑制該酶表達，從而抑制啟動子甲基化，導致MEG3表達顯著增加、α-SMA和COL1α1表達減少、LX-2細胞增殖被抑制。另外，TGF-β1能使LX-2細胞增殖，而MEG3表達增加可激活p53，進而促進線粒體內細胞色素C釋放至細胞質，使半胱天冬酶3活化，最終導致LX-2細胞凋亡，表明MEG3參與LX-2細胞凋亡。提示MEG3在HSC活化及肝纖維化進程中發(fā)揮重要作用。

2.2 生長停滯特異性轉錄本5(GAS5) GAS5最初是在生長抑制的鼠纖維原細胞中呈高表達而被發(fā)現(xiàn)，定位于人染色體1q25.1的小開放閱讀框，全長630個核苷酸。Yu等[25]首次發(fā)現(xiàn)GAS5通過GAS5/miR-222/p27軸抑制HSC活化及增殖，從而參與抗肝纖維化。GAS5在小鼠、大鼠、人的纖維化肝組織及活化的HSC中表達下降。lncRNA作為ceRNA的特點主要包括：發(fā)生相互作用的lncRNA與miRNA主要存在于細胞質[26]；lncRNA的復制數(shù)目較miRNA多[27]。GAS5與miR-222之間的關系符合上述特點，因此認為GAS5是一種ceRNA。GAS5可競爭性結合miR-222，使miR-222表達減少，p27蛋白表達增加，而p27蛋白能夠抑制細胞周期。肝纖維化時，GAS5表達下降，故miR-222表達增加，miR-222抑制p27表達，進而促進HSC活化及增殖。

2.3 基因間長鏈非編碼RNA-p21(lincRNA-p21) lincRNA-p21在人、小鼠肝纖維化肝臟組織、HSC和HBV感染患者血清中表達均減少[28]。lincRNA-p21表達下降與其啟動子甲基化有關。lincRNA-p21參與抗肝纖維化與多條信號通路相關。首先，lincRNA-p21作為ceRNA，與miR-181b競爭性結合，減弱miR-181b對PTEN表達的抑制作用，增強PTEN表達，最終抑制HSC活化。其次，miRNA調控的Wnt/β-catenin信號通路與HSC活化相關，過度表達lincRNA-p21能抑制HSC活化和Wnt/β-catenin信號通路，這一效應可完全被miR-17-5p抑制。因此，通過lincRNA-p21/miR-17-5p/β-catenin信號通路軸，lincRNA-p21能抑制HCS活化。故lincRNA-p21表達上調能夠抑制HSC活化和增殖，甚至將HSC從活化狀態(tài)逆轉為靜止狀態(tài)，從而顯著減少α-SMA和COL1α1水平，減輕肝纖維化的嚴重程度[28]?？傊?，lincRNA-p21調節(jié)HSC活化，其有可能成為肝纖維化治療的新靶點。

3 lncRNA在肝纖維化診斷和治療中的應用價值

在人體血清、血漿等體液中存在大量穩(wěn)定的lncRNA，研究循環(huán)血lncRNA表達變化與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關系，是為了使用無創(chuàng)性診療手段輔助甚至代替目前的有創(chuàng)診療手段。HBV相關肝纖維化患者血清lncRNA-ATB水平越高、lincRNA-p21水平越低提示肝纖維化程度越嚴重。受試者工作特征(ROC)曲線分析表明，血清lincRNA-p21對肝纖維化的診斷具有100%的敏感性和70%的特異性。證實血清lncRNA水平可反映肝纖維化的嚴重程度；lncRNA是診斷肝纖維化的潛在標志物。

以往肝纖維化的治療主要以抗纖維化藥物為主，治療效果不佳，長期服用易引發(fā)嚴重不良反應，且不能逆轉肝纖維化。肝源難求及肝移植后的排異反應限制了肝移植的開展。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化時肝組織中異常表達的lncRNA參與了肝纖維化的發(fā)生。因lncRNA調控著大量的人類蛋白編碼基因，所以可以選擇特定的lncRNA干預其靶基因，從而調控肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。理論上，lncRNA表達增加的肝纖維化，導入反義核苷酸下調lncRNA，恢復其正常調節(jié)水平可治療肝纖維化；lncRNA表達下調的肝纖維化，將lncRNA導入體內，如通過慢病毒載體介導GAS5、lincRNA-p21轉入目標體內可分別增加GAS5、lincRNA-p21表達，抑制肝纖維化發(fā)展。

目前動物和肝纖維化患者樣本均顯示lncRNA在肝纖維化中發(fā)揮作用，但其具體作用機制尚不明確。今后的研究將致力于尋找準確將lncRNA導入體內并使其充分發(fā)揮作用的方法；準確鑒定lncRNA的靶目標，并使導入體內的lncRNA作用于特定的與肝纖維化發(fā)病相關的靶目標。隨著對lncRNA生理作用及其在肝纖維化發(fā)病中的作用機制的深入研究，通過調節(jié)肝纖維化患者體內lncRNA活性治療肝纖維化有可能成為現(xiàn)實。