新西蘭大白兔局部牙槽骨缺損模型的建立

龐永志，尹靜，王晉，李大魯(濟南市口腔醫(yī)院，濟南250000)

多種口腔常見病(牙周炎、外傷、腫瘤等)均可造成局部牙槽骨缺損，臨床修復治療困難，且病程長。隨著國人生活水平及醫(yī)療水平的提高，牙齒種植已在臨床普遍推廣。然而越來越多的患者面臨骨量不足的問題。研究探尋理想的牙槽骨再生和修復的生物材料是口腔醫(yī)學研究的熱點與難點。臨床急需一種性能與自體骨類似，植入后最終能被爬行替代的人工骨材料。為解決這一臨床難題，首先需要選擇合適的動物來構建牙槽骨缺損模型，為研究骨替代材料奠定基礎。猴、猩猩等靈長類動物牙槽骨與人類最相似，但其價格較高，飼養(yǎng)管理難度較大，難以推廣造模；鼠類因個體較小，手術操作不便。成年新西蘭大白兔個體適中，性情溫順，價格便宜，便于飼養(yǎng)。兔以前牙抓取切斷食物，以磨牙為咀嚼中心進食，所以在其第一磨牙與中切牙之間制作骨缺損，避免因手術造成進食困難，影響研究結果。目前國內(nèi)有關建立局部牙槽骨缺損模型的研究較少，而在相關研究牙槽骨缺損修復材料的實驗中制造牙槽骨缺損的方法各異。2016年11月～2017年2月，本研究建立兔局部牙槽骨缺損模型，為骨移植材料在牙槽骨缺損的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 健康純種普通級新西蘭大白兔20只，3月齡，體質量2.0～2.5 kg、平均2.36 kg，雌雄不限，購自濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心，許可證號SCXK(魯)20100005，飼養(yǎng)于山東省千佛山醫(yī)院實驗動物中心。分籠飼養(yǎng)，實驗室常規(guī)定期消毒，溫度維持20 ℃左右，相對濕度50%±2%，通風良好，按照標準進行飼養(yǎng)。所有動物口腔黏膜顏色正常，牙齒無損壞，舌活動自如。實驗過程中對動物的處置參照中華人民共和國科學技術部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。戊巴比妥鈉(德國Merck公司)；AE240型電子分析天平(瑞士METTLER公司)、FSX100型光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、Lunar prodigy型雙能X線骨密度儀(美國GE公司)、KODAK2200型口腔X射線機(法國Trophy生產(chǎn))、EX-203型口腔慢速手機(日本NSK公司)、堿性磷酸酶試劑盒(美國sigma公司)、Sunrise型酶標儀(瑞士Tecan公司)、FSH-2A型高速勻漿機(國立常州實驗設備研究所)。

1.2 牙槽骨缺損動物模型建立 術前適應性飼養(yǎng)1周，禁食12 h、禁水8 h。經(jīng)兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，麻醉后將其仰臥位固定于動物實驗臺上，術區(qū)常規(guī)消毒鋪巾，口內(nèi)再次消毒，手指觸摸到下頜體上緣黏膜最薄處，于第一磨牙近中齦緣前方約5 mm與切牙遠中齦緣后方約5 mm之間用11號尖刀片切開黏骨膜。剝離子剝離暴露骨面，于第一磨牙與中切牙中間處，用口腔科種植手機(800 r/min)配備直徑2 mm裂鉆垂直制備約4 mm×4 mm×4 mm骨缺損，邊磨邊生理鹽水沖洗，間斷磨除，磨至骨松質后用口腔科小刮尺刮至牙根面，生理鹽水清洗創(chuàng)面，棉球壓迫止血。無明顯出血后，用1號線全層縫合切口。造模后在右側臀大肌處肌注青霉素，40萬U/次，2次/d，連續(xù)3 d。造模后飼養(yǎng)條件同術前。觀察并記錄造模后動物精神、飲食、兩便、活動及傷口愈合情況。分別于造模后1、4、8、12周各隨機選取5只動物經(jīng)耳緣靜脈注射過量戊巴比妥鈉將其處死，完整取出雙側下頜骨體部，去軟組織，觀察標本局部成骨情況。

1.3 牙槽骨缺損影像學檢查 將不同時間點取得的牙槽骨缺損標本置于口腔X射線機下拍片。拍攝條件：距離10 cm，電壓70 kV，電流7 mA，曝光時間0.051 s。觀察不同時間點骨缺損修復情況。用雙能X線骨密度儀測量骨缺損處骨密度，測得骨缺損修復區(qū)骨礦鹽含量、成骨質量及成骨速度。選取包含骨缺損的6 mm×5 mm范圍作為測量區(qū)域。每標本測量3次，取平均值。

1.4 牙槽骨缺損組織學變化觀察 用口腔科高速手機在骨缺損近遠中各2 mm處鋸下標本，均分為兩份。一份于10%中性甲醛溶液中固定2 d，流動水沖洗2 h，常規(guī)脫鈣72 h，逐級脫水，石蠟包埋，按頰舌向縱切，連續(xù)切取厚度2 μm切片，選取組織塊中心部位切片2張，行蘇木精-伊紅染色，于FSX100顯微鏡下觀察新骨形成情況并采集圖片。

1.5 成骨細胞活性測定 取骨缺損標本定量后勻漿，加PBS緩沖液提取，3 000 r/min離心30 min，取上清液。嚴格按堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒說明書進行操作，用酶標儀于450 nm波長處測吸光度值，獲得每克標本中ALP活性作為成骨細胞活性。

2 結果

2.1 造模后不同時間點實驗動物一般情況比較 實驗動物造模后反應良好，體溫不高，精神略差，飲食及活動減少，切口周圍軟組織略腫脹，3～5 d恢復正常，7 d切口甲級愈合，無感染、裂開、壞死，縫線隨飲食自行脫落。術區(qū)及周圍均未見急性炎癥反應。造模后1周牙槽骨缺損切口表面黏膜略紅腫，刮除表面瘢痕組織后可見明顯凹陷骨洞區(qū)，缺損處被肉芽組織及血凝塊充填。造模后4周口內(nèi)黏膜顏色正常，縫線已自行脫落，縱切面觀骨缺損處填滿纖維組織及纖維骨痂，探有硬度，骨洞區(qū)變淺，有少許新生骨形成。造模后8周牙槽骨缺損骨洞進一步變淺，表面粗糙，但凹陷較明顯，縱切面觀察新生骨與與周圍骨界限不清。造模后12周骨缺損處與周圍骨組織界限不清，表面略粗糙，骨缺損處凹陷較明顯，顏色較周圍骨組織偏淺?？v切面觀察骨缺損處與周圍骨已無界限，但靠近缺損處中央，仍有少量纖維組織殘留。

2.2 造模后不同時間點牙槽骨缺損影像學檢查結果比較 造模后1周骨缺損處低密度影像明顯，邊界清晰。造模后4周骨缺損處邊緣見云霧狀改變，可見阻射的骨小梁影像，以缺損底端最為明顯。造模后8周骨缺損處邊界分辨不清，骨缺損處密度仍相對較低，低密度影像向中心縮小，骨缺損表面阻射度仍較低。造模后12周缺損處底端與周圍松質骨無明顯區(qū)別，表面骨密度偏低。造模后1、4、8、12周牙槽骨缺損處及非手術區(qū)正常牙槽骨骨密度分別為(0.176±0.005)、(0.198±0.011)、(0.277±0.003)、(0.301±0.014)、(0.358±0.011)g/cm2。牙槽骨缺損骨密度值正常牙槽骨>造模后12周>造模后8周>造模后4周>造模后1周，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。

2.3 造模后不同時間點牙槽骨缺損組織學變化比較 造模后1周骨缺損處內(nèi)部見較多炎性細胞，以急性粒細胞為主，有少許血凝塊尚未被吸收。造模后4周骨缺損處見有新生骨小梁生成，但較細，散亂排布，邊緣可見單層排列的成骨細胞，骨小梁內(nèi)骨細胞較為活躍，骨小梁之間有較多血管發(fā)生。造模后8周骨缺損處四周骨小梁粗大，較多已聯(lián)合，纖維組織逐漸減少并開始鈣化為類骨質，新生骨與宿主界面不清，成骨細胞密度有所下降，但骨缺損中央處骨小梁較纖細，纖維組織較多。造模后12周骨缺損處骨小梁粗大致密，較多聯(lián)合成片狀，骨小梁邊緣成骨細胞較活躍，有豐富的血管網(wǎng)，負重區(qū)向成熟的板層骨改建，內(nèi)部為骨髓腔較大的松質骨結構，但相對周圍正常骨床仍顯雜亂，骨結構層次性相對稍差。

2.4 造模后不同時間點牙槽骨缺損組織中成骨細胞活性比較 造模后1、4、8、12周牙槽骨缺損組織中ALP活性分別為(2.67±0.13)、(28.24±0.29)、(21.79±0.21)、(11.48±0.38)U/g。造模后第1周ALP活性最低，第4周活性最高，之后逐漸降低，12周時仍維持較高水平，各時間點比較差異有統(tǒng)計學意義(P均﹤0.05)。

3 討論

牙槽骨缺損的修復與再生一直是口腔醫(yī)學界亟待解決的問題之一。應用于牙槽骨缺損修復的材料有羥基磷灰石、生物活性玻璃等諸多材料，組織工程技術是修復骨缺損較前沿的研究，然而動物實驗是每種材料應用于臨床的必經(jīng)環(huán)節(jié)，為便于學者們多角度研究牙槽骨缺損行之有效的骨替代材料，動物模型是首要解決的問題。

在研究牙槽骨缺損移植材料的實驗動物選擇上，早期國外較多學者以大鼠為研究模型[1～3]，大鼠個體小，存在手術操作困難，即使手術造模成功，仍面臨骨移植物難以植入的缺點。在牙槽骨缺損重建的研究上，多數(shù)學者開始以羊或犬為模型開展研究[4～7]，或者以小型豬為實驗對象[8,9]。羊、犬、小型豬均屬大型動物，盡管能較好地復制人類牙槽骨缺損模型，但存在飼養(yǎng)成本高、管理難度大等問題。兔成為多數(shù)學者的首選，然而模型的制作方法各異。兔上頜骨腭弓弧度較大，黏骨膜較厚，且受張口度的限制，不宜制作骨缺損。在下頜骨的模型制備中，胡楊等[10]提出用拔除雙側下頜中切牙的方式制備缺損模型，但兔切牙牙根較長，牙根一直延續(xù)到頦孔位置，牙根尖端與牙頸部直徑相當，無明顯根尖，成年兔切牙冠根比約為1∶8，牙根牙本質較薄，髓腔粗大，且牙根彎曲明顯，拔除較為困難。牙頸部周緣牙槽嵴較薄，拔除中較易出現(xiàn)牙槽嵴骨折，且較易牙根折斷，殘留斷根可能造成骨缺損的研究結果失真。前期研究中，參考吳哲等[11]在大鼠牙槽嵴吸收模型中的方法，用裂鉆將兔的切牙牙冠磨除1/2，在其尚未恢復咬合關系時，再次磨除1/2，先后磨除4次后，切牙出現(xiàn)松動，分離牙齦后能夠將其拔除，但因反復麻醉，動物數(shù)量較多，實驗周期過長，不適合作為牙槽骨缺損的模型推廣。在進行第一磨牙的拔除時，均遇到同樣困難。馬躍等[12]在比較倍骼生與羥基磷灰石在牙槽骨的修復效果時，采用縱行劈開下頜骨下緣的方法對比材料性能，此種方法需在口外切開，手術創(chuàng)傷大，操作難度高，造模后可能會影響動物進食。富建明等[13]在下頜骨體部磨牙區(qū)頰側制作1.5 cm×1.5 cm骨缺損模型來研究材料的修復效果，但兔頰側密質骨約0.44 mm，松質骨約1.34 mm，該厚度較難植入材料，植入材料后材料易流失，難以客觀評價材料的成骨效果。房殿吉等[14]通過在兔下頜支頰側中下制備直徑1 cm全層骨缺損，深度0.5～0.6 cm，此方法會磨除部分磨牙牙根，暴露的牙髓組織可能會影響實驗結果，且手術會影響動物進食。另有部分學者在下頜升支處制造骨缺損模型，下頜升支骨壁較薄，植入植骨材料穩(wěn)定性差，且下頜升支骨質與牙槽骨骨質在組織學上有區(qū)別，不能有效模仿牙槽骨缺損或牙周骨缺損。本課題組在下頜中切牙與第一磨牙之間的無牙區(qū)制作牙槽骨缺損模型，此位置手術不受開口度的限制，視野清楚，操作簡單，不損傷頦神經(jīng)，且基本不影響造模后動物的進食，能夠較好地為骨移植材料在牙槽骨上的應用提供參考。

人類局部牙槽骨急性缺損后，血凝塊充滿缺損區(qū)，24 h機化，逐步被肉芽組織替代；3～4 d后肉芽組織向纖維組織轉化；2周后骨缺損處骨小梁增生，進入機化的血凝塊，缺損區(qū)底端最先有新骨新成；3個月后，新生骨基本長滿缺損區(qū)，同時靠近軟組織側，軟組織的增值導致凹形骨缺陷。本實驗中骨缺損造模后自然恢復過程與人類局部牙槽骨缺損后的自然恢復過程類似，能較好地模擬人類局部牙槽骨缺損的修復過程。本實驗中骨密度測量顯示隨時間推移，骨缺損處骨密度逐漸增高，12周時骨密度達最高但仍低于周圍正常骨骨密度。因骨缺損處頰舌側各有骨板阻擋，所以骨缺損處實際骨密度值要低于測量值，但各組動物均未排除此干擾因素，所以此干擾因素不影響各組的數(shù)據(jù)比較。堿性磷酸酶活性在第4周時達頂峰，說明成骨細胞在此階段最為活躍，12周時仍較高，表明骨缺損處組織仍在向成熟骨組織改建中。

在兔下頜第一磨牙與中切牙中間的無牙區(qū)制造約4 mm×4 mm×4 mm缺損，所建模型全部成活，通過對每個時間點的監(jiān)測，能夠客觀評價局部牙槽骨缺損后的自然修復過程。未來研究某種骨替代材料時，將其植入模型中，同樣能夠評價研究材料的性能；而且此種模型建立簡單、評價客觀。通過各項指標的檢測，得出牙槽骨缺損自然愈合狀況下的數(shù)據(jù)，為以后研究骨替代材料性能時提供參考；同時本實驗將各種檢測方法敘述清晰，可作為骨替代材料隨時間修復效果檢驗的參考。

綜上所述，本實驗提出的在下頜第一磨牙與中切牙之間的無牙區(qū)制備牙槽骨缺損模型的方法，有操作簡單、重復性強、便于材料植入、缺損底端為牙根面等諸多優(yōu)點，為骨移植材料在牙槽骨缺損修復效果的評價奠定了基礎。

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