miR-let7c對小鼠精原細(xì)胞株GC-1spg細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A表達(dá)的調(diào)控作用

王歡，江莉，唐媛媛，周潔

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

男性不育癥病因復(fù)雜，目前認(rèn)為主要的病因有染色體結(jié)構(gòu)或基因調(diào)控異常、全身性或神經(jīng)性疾病、感染、外傷、醫(yī)源性損傷、內(nèi)分泌失調(diào)、環(huán)境因素、免疫因素等。精子發(fā)生是一個復(fù)雜的多因素調(diào)控過程，miRNA通過調(diào)控其靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯而影響精子發(fā)生過程。研究表明，miRNA let7家族在精子運動、獲能、受精和胚胎發(fā)育中有重要作用，但具體機(jī)制不清楚[1]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A(CDKN1A)是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKI)家族成員之一，是細(xì)胞周期重要的調(diào)控因子。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-let7c沉默及過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒載體，初步研究miR-let7c對精原細(xì)胞系GC-1spg中CDKN1A表達(dá)的影響，探討miR-let7c對精子發(fā)生影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠精原細(xì)胞株GC-1spg購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫；miR-let7c過表達(dá)、沉默表達(dá)慢病毒和空載對照慢病毒包裝等由上海吉凱基因科技有限公司完成；AxyPrep總RNA小量制備試劑盒購自Axygen公司；引物內(nèi)參GAPDH、Reverse Transcriptase、SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，引物設(shè)計、合成也由日本TaKaRa公司完成；10%胎牛血清、Trypsin-EDTA Solution和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；內(nèi)參β-actin(HRP標(biāo)記)購自PTG公司；羊抗兔二抗購自ABCAM公司。

1.2 miR-let7c慢病毒載體的構(gòu)建 設(shè)計合成帶有末端保護(hù)堿基、AgeI、EcoRI的酶切位點的mmu-miR-let7c引物。mmu-miR-let7c上游引物序列為5′-GGAAAGGACGAAACACCGGTATTCTATCTACAACC-TTGCCAAGC-3′，下游引物序列為5′-TGTCTCGAGGTCGAGAATTAAAAAAGGTAATGCATTAAGGCCTC-3′；mmu-let-7c-5p-inhibition上游引物序列為5′-AATTCAAAAATGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT-3′，下游引物序列為5′-CCGGAACCATACAACCTACTACCTCATTTTTG-3′。擴(kuò)增pre-miR-let7c序列。經(jīng)酶切后連接入慢病毒表達(dá)載體GV309(miRNA慢病毒載體)或GV280(miRNA-inhibition慢病毒載體)，慢病毒載體元件順序：hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。經(jīng)轉(zhuǎn)化、PCR法篩選挑取陽性克隆，經(jīng)測序鑒定為pre-miR-let7c序列后抽提質(zhì)粒。GV309-miR-let7c(對照組為GV309空質(zhì)粒)、Helper1.0、Helper 2.0三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以10%FBS的DMEM培養(yǎng)48～72 h后收集上清即為病毒。

1.3 細(xì)胞分組及miR-let7c過表達(dá)、沉默表達(dá)慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 GC-1spg細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放置在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。將處于對數(shù)生長期的GC-1spg細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液分入6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)融合度為10%～20%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)miR-let7c上調(diào)組、miR-let7c下調(diào)組和對照組，分別轉(zhuǎn)染miR-let7c過表達(dá)慢病毒、miR-let7c沉默表達(dá)慢病毒、空載病毒，感染復(fù)數(shù)(MOI)=75，感染72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)并計算轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率>90%者繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.4 各組精原細(xì)胞CDKN1A mRNA檢測 提取各組精原細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度及純度。按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照行實時熒光定量PCR反應(yīng)。CDKN1A上游引物序列為5′-GTCGCTGTCTTGCACTCTGG-3′，下游引物序列為5′-CCAATCTGCGCTTGGAGTGATA-3′；GAPDH上游引物序列為5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，下游引物序列為5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。實時定量PCR反應(yīng)體系均為20 μL，其中包括Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物終濃度0.8 μmol/L，其余體積用滅菌水補(bǔ)足。在Lightcycler 96 PCR儀中使用兩步法擴(kuò)增：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火與延伸60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。每次循環(huán)結(jié)束時收集熒光。以2-ΔΔCt表示三組CDKN1A mRNA相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 三組CDKN1A蛋白檢測 采用Western blotting法。先用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白光密度(OD)值，根據(jù)蛋白含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，配置5%濃縮膠和12%分離膠，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，80 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)跑出濃縮膠層，時間約為30 min，分離膠電泳為120 V。當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至距離分離膠下緣約1 cm時終止電泳，轉(zhuǎn)膜。400 mA穩(wěn)流電轉(zhuǎn)移1 h，將PVDF膜浸入5% BSA的封閉液中，室溫封閉1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光顯影。以CDKN1A條帶和內(nèi)參照β-actin條帶灰度值之比表示CDKN1A蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組CDKN1A mRNA表達(dá)比較 miR-let7c上調(diào)組、miR-let7c下調(diào)組、對照組CDKN1A mRNA相對表達(dá)量分別為0.005 6±0.000 9、0.039 1±0.006 7、0.021 9±0.001 8。與對照組比較，miR-let7c上調(diào)組CDKN1A mRNA相對表達(dá)量低于miR-let7c下調(diào)組及對照組(P均<0.01)，miR-let7c下調(diào)組CDKN1A mRNA相對表達(dá)量高于對照組(P<0.01)。

2.2 三組CDKN1A蛋白表達(dá)比較 miR-let7c上調(diào)組、miR-let7c下調(diào)組、對照組CDKN1A蛋白相對表達(dá)量分別為0.034 8±0.002 6、0.833 5±0.053 2、0.257 4±0.070 9。與對照組比較，miR-let7c上調(diào)組CDKN1A蛋白相對表達(dá)量低于miR-let7c下調(diào)組及對照組(P均<0.01)，miR-let7c下調(diào)組CDKN1A蛋白相對表達(dá)量高于對照組(P<0.01)。

3 討論

miRNA是內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，長度為22～24個核苷酸。miRNA通過與靶mRNA 3′-UTR區(qū)形成互補(bǔ)序列，使靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后水平[2]。miRNA主要是對內(nèi)源性mRNA進(jìn)行修飾，并且在表達(dá)上具有發(fā)育時序性和組織特異性，參與細(xì)胞的生長、增殖和凋亡等過程。miRNA在哺乳動物的睪丸、附睪、精子和精漿中廣泛表達(dá)，并在原始生殖細(xì)胞(PGCs)、精原干細(xì)胞(SSCs)和精原細(xì)胞中有更高的表達(dá)水平，參與精子發(fā)生發(fā)育和成熟的各個階段[3]，因而被認(rèn)為是生殖細(xì)胞發(fā)育的強(qiáng)有力調(diào)節(jié)器。目前已發(fā)現(xiàn)miR-17-92簇和miR-let-7家族(a、d、e、c、g)能調(diào)控PGCs增殖和發(fā)育。miR-17-92基因簇是含有共同miRNAs位點的4個不同miRNA家族(miR-17、miR-18、miR-19、miR-25)，可能參與SSCs的早期分化，也在未分化的精原細(xì)胞中表達(dá)，在分化過程中表達(dá)下調(diào)。miR-17-92基因簇能下調(diào)E2F1基因，避免精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂的細(xì)胞凋亡。敲除miR-17-92基因簇的成年小鼠，其生殖功能障礙，出現(xiàn)異常的睪丸表型，包括睪丸嚴(yán)重萎縮、精原細(xì)胞和SSCs丟失、生殖細(xì)胞凋亡和精子生成減少等[4]。let7被廣泛用于腫瘤和干細(xì)胞包括多種細(xì)胞抗凋亡和增殖途徑的相關(guān)研究[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，let-7能直接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期關(guān)鍵的原癌基因，如RAS、CDC25A、CDK6、Cyclin D等，阻斷細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)換過程，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[6]。精子發(fā)生是精原干細(xì)胞不斷自我更新、動態(tài)的、復(fù)雜的過程，SSCs的自我更新和細(xì)胞池之間的平衡受到嚴(yán)格而周密的調(diào)控，當(dāng)SSCs出現(xiàn)過度的自我更新或分化時，打破了平衡的調(diào)控網(wǎng)，從而導(dǎo)致男性不育[7]。Toledano等[8]研究發(fā)現(xiàn)let-7過表達(dá)可導(dǎo)致果蠅生殖干細(xì)胞減少。Shinoda等[9]認(rèn)為過表達(dá)的let-7通過靶向Lin28a減少雄性生殖細(xì)胞的數(shù)量。此外，精漿中miR-19b和let-7a的異常表達(dá)可導(dǎo)致生精障礙[10]。在睪丸組織中，miR-let-7a-1、miR-let-7a-2、miR-1et-7a-3、miR-let-7b、miR-1et-7c、miR-let-7d、miR-let-7d-v1、miR-let-7d-v2、miR-let-7e、miR-let-7f-1、miR-let-7g等特異表達(dá)，在維持干細(xì)胞增殖、分化和自我更新能力的過程中也起到重要調(diào)控作用。因此我們選擇miR-let7c為研究目標(biāo)，探討其在精子發(fā)生中的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示miR-let7c上調(diào)組GC-1spg細(xì)胞中CDKN1A mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低，miR-let7c下調(diào)組GC-1spg細(xì)胞中CDKN1A mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高，說明miR-let7c能夠負(fù)向調(diào)控CDKN1A的表達(dá)。miRNA的調(diào)控作用貫穿到精子發(fā)生發(fā)育和成熟的整個過程。這些過程需要一個精準(zhǔn)的、具有空間性和時間性的基因調(diào)控表達(dá)模式。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些與精子活力有關(guān)的基因，如Tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11、AKAP3、AKAP4、SEPT4、SMCP、SEMG1、CRISP2等。CDKN1A是細(xì)胞周期重要的負(fù)性調(diào)控因子，可與G1-S/CDK(G1-S/細(xì)胞周期蛋白依賴激酶，CDK2)和S/CDK復(fù)合物結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1期向S期過渡過程[11]，在轉(zhuǎn)錄、翻譯后修飾、DNA復(fù)制和修復(fù)等途徑中發(fā)揮重要作用。此外CDKN1A還扮演調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和細(xì)胞凋亡的雙重角色，這主要取決于CDKN1A在細(xì)胞內(nèi)的定位[12]。CDKN1A對調(diào)節(jié)精原干細(xì)胞種系傳遞起關(guān)鍵作用，被認(rèn)為是維持睪丸生殖細(xì)胞完整性的守護(hù)者[13]。在正常睪丸組織，CDKN1A在粗線期精母細(xì)胞和精子細(xì)胞中的表達(dá)最高[5]。精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和精子等雄性生殖細(xì)胞對DNA損傷因素易感，而DNA損傷途徑受到CDKN1A的調(diào)控，后者還參與DNA損傷后的細(xì)胞周期進(jìn)程[14,15]。當(dāng)CDKN1A的表達(dá)受到抑制，在細(xì)胞沒有進(jìn)行DNA修復(fù)的時候就進(jìn)入細(xì)胞周期，復(fù)制了錯誤的遺傳信號，阻滯了細(xì)胞周期進(jìn)程。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者推測，在SSCs的自我更新或分化中，為了避免出現(xiàn)過度活躍的細(xì)胞增殖，miR-let7c通過負(fù)向調(diào)控CDKN1A而抑制細(xì)胞增殖，阻滯了細(xì)胞周期G1期向S期過渡，維持SSCs細(xì)胞池之間的平衡，確保精子發(fā)生調(diào)控過程的精準(zhǔn)性。

目前對miRNA參與生殖細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控作用的研究主要集中在精子發(fā)生的中晚期階段，而對精子發(fā)生早期階段的研究較少，尤其是從精母細(xì)胞到精原細(xì)胞的過程。本研究結(jié)果為后續(xù)探討miR-let7c在男性不育臨床診斷及治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。而miR-let7c如何通過CDKN1A調(diào)控精子發(fā)生的作用機(jī)制將有待進(jìn)一步研究。

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