衛(wèi)楊林,殷子斐,李霞
(1上海中醫(yī)藥大學(xué),上海201203;2第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院)
肺纖維化是一類慢性進(jìn)行性加重疾病,可導(dǎo)致患者的肺功能逐漸惡化。其實(shí)質(zhì)是肺泡損傷,肺組織過(guò)度修復(fù)、重塑的過(guò)程,肺臟組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少,纖維結(jié)締組織異常增多的疾病。肺纖維化患者的中位生存期僅2~5年,5年存活率只有20%[1]。目前臨床上常用的治療方法雖然有戒煙、氧療、機(jī)械通氣等非藥物治療方法,以及吡非尼酮、尼達(dá)尼布、N-乙酰半胱氨酸等抗纖維化、抗氧化藥物,但療效欠佳[2]。肺移植是肺纖維化終末期的惟一治療途徑,能提高患者生存率,但畢竟供體有限,且治療費(fèi)用昂貴,難以惠及更多患者。因此,積極深入開展肺纖維化的相關(guān)研究,提高肺纖維化的診斷和治療水平迫在眉睫。與體內(nèi)研究相比,體外研究具有簡(jiǎn)便迅速、條件易控制等優(yōu)點(diǎn),在疾病研究和藥物研發(fā)中應(yīng)用較廣。目前,肺纖維化的體外研究主要是結(jié)合肺纖維化的病因和發(fā)病機(jī)制,對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行適當(dāng)干預(yù),模擬肺纖維化的病理過(guò)程。因細(xì)胞種類、干預(yù)方式的不同,目前有多種關(guān)于肺纖維化體外模型的建立方法?,F(xiàn)就近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛的肺纖維化的體外模型的建立方法進(jìn)行系統(tǒng)綜述。
隨著對(duì)肺纖維化研究的深入,現(xiàn)已證實(shí)部分肺纖維化的發(fā)生有一定的病因,大多數(shù)由于外界物質(zhì)的接觸所導(dǎo)致,如暴露于藥物、塵埃、化學(xué)試劑等。因此,可以利用這些病因作為細(xì)胞模型的誘導(dǎo)劑,建立肺纖維化的體外模型。
1.1博來(lái)霉素(BLM)BLM是一種抗腫瘤藥物,但可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積和炎性反應(yīng),促進(jìn)肺纖維化形成,常用來(lái)作為動(dòng)物肺纖維化模型的誘導(dǎo)劑[3]。Della Latta等[4]取少量肺組織經(jīng)消化得到的原代肺纖維細(xì)胞,用不同濃度范圍BLM(0~3.5 μg/mL)刺激4 h后,發(fā)現(xiàn)原代肺纖維細(xì)胞中血管炎癥標(biāo)志物穿透素3和TNF-α mRNA表達(dá)量均增加。Huang等[5]用BLM(3 mU/mL)刺激人肺成纖維細(xì)胞24、48、72 h后,發(fā)現(xiàn)TGF-β1mRNA表達(dá)量分別是空白組的60、40、20倍;而預(yù)先用TGF-β1抗體處理1 h后再給予BLM刺激,發(fā)現(xiàn)此時(shí)纖連蛋白(FN)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的蛋白和基因水平與空白組基本相同。
1.2百草枯(PQ) PQ是一種高毒性除草劑,肺是其作用的主要靶器官,表現(xiàn)為急性肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化的迅速形成,從而能誘導(dǎo)人和動(dòng)物形成肺纖維化疾病,其主要是通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)引起的,并且有TGF-β/Smad信號(hào)通路的參與[6]。高燁等[7]將PQ(50 μmol/L)與人肺上皮細(xì)胞HPAEpiC共同孵育24 h后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞從鵝卵石樣上皮形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣梭形形態(tài),上皮性標(biāo)志物E-cadherin蛋白的表達(dá)下調(diào),而間質(zhì)性標(biāo)記物N鈣黏著蛋白(N-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)和Vimentin mRNA表達(dá)量均增加。
1.3二氧化硅(SiO2) SiO2粉塵是一種工業(yè)粉塵,長(zhǎng)期吸入會(huì)造成嚴(yán)重的肺損傷。當(dāng)肺中巨噬細(xì)胞吞噬大量粉塵后,會(huì)分泌相關(guān)活性因子,產(chǎn)生其他炎癥反應(yīng)促進(jìn)矽肺的形成。Liang等[8]先用SiO2(250 μg/mL)刺激小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞RAW264.7,24 h后用其上清液來(lái)培養(yǎng)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞RLE-6TN,24 h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)了60%,而Vimentin、FN和Ⅰ型膠原(ColⅠ)蛋白表達(dá)都明顯上調(diào),分別升高了1.2、1.2、1.3倍;同時(shí)也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移活性增強(qiáng),表現(xiàn)出纖維母細(xì)胞樣形態(tài)。郝小惠等[9]用SiO2(50 μg/mL)混懸液刺激人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞,結(jié)果顯示水通道蛋-1(AQP-1)mRNA在2 h達(dá)到高峰(為空白組的3.85倍);AQP-1蛋白表達(dá)也上調(diào)并在6 h時(shí)達(dá)到峰值。
1.4 碳納米管(CNT) CNT是一種新型碳質(zhì)納米材料,可分為單壁碳納米管(SWCNT)和多壁碳納米管(MWCNT),對(duì)體內(nèi)的毒性主要為肺部炎癥和纖維化。肺內(nèi)CNT的持續(xù)存在會(huì)發(fā)起一種早期炎癥反應(yīng),其特征是產(chǎn)生趨化因子誘導(dǎo)肺纖維細(xì)胞的慢性活化,分泌成纖維的生長(zhǎng)因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF),加重ECM(主要為膠原蛋白、纖維蛋白)沉積,導(dǎo)致漸進(jìn)性纖維化[10]。Wang等[11]用MWCNT(15~60 μg/mL)刺激鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3,48 h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞特異性蛋白-1(FSP-1)、α-SMA和Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)蛋白均有上升趨勢(shì),并呈劑量依賴;劑量為30 μg/mL時(shí)成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(FSP-1)、α-SMA、Col Ⅲ mRNA表達(dá)量分別是空白組的2、2.5、2.2倍。
1.5粉塵螨粉塵螨粗提物是體外過(guò)敏原刺激物,能夠誘發(fā)肺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌炎癥相關(guān)因子,如IL-6等誘導(dǎo)肺纖維化的形成。已有研究[12]發(fā)現(xiàn),IL-6在纖維結(jié)締組織和平滑肌增生過(guò)程中發(fā)揮重要的作用,可促進(jìn)膠原蛋白聚集和成纖維細(xì)胞的增殖,抑制ECM降解。陳詩(shī)皓等[13]在培養(yǎng)原代小鼠固有淋巴樣2型細(xì)胞ILC2中加入10 μg/mL的粉塵螨粗提物,在24、36、48 h時(shí)收集細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其IL-6水平分別是空白組1、2、3倍;并且IL-6 mRNA的含量也逐漸升高,分別是空白組的5、10、15倍,呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性。
無(wú)論是病因明確的肺纖維化,還是其他病因不明的肺纖維化,其病理機(jī)制主要為成纖維細(xì)胞異常增殖轉(zhuǎn)型和ECM大量沉積。目前研究已經(jīng)證實(shí),肺纖維化的進(jìn)程離不開細(xì)胞因子的介導(dǎo),這些細(xì)胞因子包括TGF-β1、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和PDGF等,它們主要從促進(jìn)纖維化形成、參與局部損傷和炎癥反應(yīng)及抑制纖維化形成3個(gè)方面參與其中[14]。因此,可以借助這些細(xì)胞因子,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),建立肺纖維化的體外模型。
2.1TGF-β TGF-β是目前公認(rèn)的致纖維化作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子,亞型中又以TGF-β1致纖維化能力最強(qiáng)[15]。Li等[16]用TGF-β1(5 ng/mL)刺激人胚成纖維細(xì)胞WI38 48 h后,發(fā)現(xiàn)β-catenin、FN和α-SMA蛋白表達(dá)均較空白組明顯增加;此時(shí),細(xì)胞形態(tài)上也呈現(xiàn)出相應(yīng)的纖維化特征。此外,TGF-β1還具有強(qiáng)烈的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。駱亞莉等[17]發(fā)現(xiàn),在同等劑量TGF-β1刺激下的人胚肺成纖維細(xì)胞HELF,其形態(tài)呈密集的團(tuán)叢狀分布且數(shù)量增多、體積增大、胞質(zhì)豐富。
2.2CTGF CTGF是TGF-β1致纖維化作用的直接下游介質(zhì),已被證實(shí)在肺、腎臟和肝臟的纖維化過(guò)程中發(fā)揮了作用,可導(dǎo)致膠原蛋白過(guò)度沉積,是重要的促纖維化因子,也是肺纖維化預(yù)后標(biāo)記物[18]。黃曉燕等[19]用CTGF(20 ng/mL)刺激人胚肺成纖維細(xì)胞HFL-Ⅰ24 h,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,α-SMA表達(dá)量為空白組的4倍。而Huang等[20]在此基礎(chǔ)上加入CTGF抑制劑后,發(fā)現(xiàn)此時(shí)的細(xì)胞增殖和遷移能力大幅度下降,ECM蛋白表達(dá)減少,但在TGF-β1的配合下,卻又促進(jìn)了肺纖維化的發(fā)展進(jìn)程。
2.3Ang Ⅱ AngⅡ是血管腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的組成部分,既是纖維增生的中介反應(yīng)物,也是纖維化的重要調(diào)控因子[21]。Hao等[22]在用BLM誘導(dǎo)的嚴(yán)重肺纖維化和彌漫性肺部炎癥小鼠中發(fā)現(xiàn),肺組織中Ang Ⅱ、IL-6、TGF-β1mRNA表達(dá)量分別升高了3、8、2倍,提示Ang Ⅱ是一種強(qiáng)有力的誘導(dǎo)因子,可通過(guò)TGF-β的自分泌,誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的凋亡,激活成纖維細(xì)胞促進(jìn)膠原蛋白產(chǎn)生和ECM合成。梁海海等[23]發(fā)現(xiàn),AngⅡ(1 μmol/L)刺激MRC-5細(xì)胞可明顯增加細(xì)胞膠原生成;并通過(guò)α-SMA染色證實(shí),細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
2.4PDGF 在纖維化早中期,PDGF可協(xié)調(diào)TGF-β1間接刺激成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和黏附,調(diào)節(jié)膠原、ECM沉積和降解,在肺纖維化性疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[24]。Hostettler等[25]用PDGF(10 ng/mL)分別刺激特發(fā)性肺纖維化(IPF)患者原代肺成纖維細(xì)胞和正常肺組織細(xì)胞48 h后,發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞增殖效應(yīng)接近100%。王志勇等[26]以人肺癌細(xì)胞A549為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)加入PDGF抗體(25 mg/L)后,可顯著加強(qiáng)細(xì)胞MMP-9的表達(dá)水平,并且可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。
2.5胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF-Ⅰ) IGF-Ⅰ是一類細(xì)胞增殖調(diào)控因子,在細(xì)胞的分化、增殖、生長(zhǎng)發(fā)育和血管新生中具有重要的作用,同時(shí)也是引起肺泡炎癥和肺間質(zhì)纖維化的重要因子[27]。Hung等[28]用IGF-Ⅰ(100 ng/mL)刺激小鼠肺成纖維細(xì)胞MLF,24 h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA表達(dá)量均升高,分別是空白組的1.5、1.7倍;α-SMA、Col Ⅰ、Col Ⅲ的蛋白含量分別是空白組1.3、2、1.6倍。
隨著肺纖維化機(jī)制研究的不斷完善以及體外造模技術(shù)的發(fā)展,目前已經(jīng)有多種造模方法。除了以上報(bào)道的常用的細(xì)胞模型方法外,還有用膽汁刺激酸肺泡上皮細(xì)胞、免疫抑制劑干預(yù)鼠胚胎成纖維細(xì)胞、石棉刺激肺泡巨噬細(xì)胞等[29,30]方法。研究者可根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件、細(xì)胞來(lái)源以及研究需要靈活地選擇。
雖然肺纖維化的體外模型的方法多種多樣,但目前關(guān)于肺纖維化建立方法的金標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。目前常用的細(xì)胞有胚胎肺成纖維細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞等,干預(yù)方式有病因和細(xì)胞因子兩大類,常用的鑒定肺纖維化的方法為觀察細(xì)胞形態(tài)、測(cè)量膠原含量、以及檢測(cè)TGF-β1、Col Ⅰ、Col Ⅲ、α-SMA、E-cadherin、Vimentin等指標(biāo)。然而,同一種細(xì)胞對(duì)不同干預(yù)方式的反應(yīng)是不一樣的,究竟采用哪種細(xì)胞接受什么樣的干預(yù)刺激,并用何種指標(biāo)來(lái)鑒定肺纖維化更具有代表性,可以作為肺纖維化體外模型的金標(biāo)準(zhǔn),目前尚未明確。另外,還需特別指出的是,目前使用的肺纖維化體外模型建立方法大都使用單種干預(yù)方式對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激。然而,肺纖維化是個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程,需要借助多種細(xì)胞、多種炎癥因子進(jìn)行參與。因此,在目前的工作基礎(chǔ)上,如何尋求多種體外模型聯(lián)合作用,才能建立更加貼近臨床的肺纖維化體外模型也是值得思考的問題。相信隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,理想而成熟的肺纖維化體外模型會(huì)逐漸建立起來(lái),從而為肺纖維化疾病的診斷和治療提供更加有效的支持。