辛伐他汀對哮喘氣道重構(gòu)小鼠肺組織TGF-β1表達(dá)的影響

汪向海，尹成勝，金藝鳳

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，安徽 蕪湖 241001)

支氣管哮喘是常見的慢性呼吸道疾病，發(fā)病機(jī)制目前仍未完全清楚。目前研究認(rèn)為氣道重構(gòu)是哮喘的重要病理基礎(chǔ)，而且氣道重構(gòu)嚴(yán)重的哮喘患者發(fā)病率和病死率明顯增加。因此控制哮喘患者的氣道重構(gòu)對哮喘的防治具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種雙鏈蛋白多肽，其對細(xì)胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用，目前研究認(rèn)為TGF-β1是哮喘氣道重構(gòu)的重要因子[1]，可以促進(jìn)氣道內(nèi)黏液腺體的增生、基底膜的增厚及氣道平滑肌的肥大增生[2-4]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物除具有調(diào)脂作用外，還具有抗炎、抑制血管和氣道平滑肌增生等作用，Huang等[5]研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以有效減少哮喘急性發(fā)作。我們應(yīng)用卵白蛋白(ovalbumin,OVA)致敏構(gòu)建哮喘小鼠氣道重構(gòu)模型，并使用辛伐他汀干預(yù)，觀察其對哮喘氣道重構(gòu)的作用，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑、實驗動物分組及主要儀器 SPF級BALB/C雌性小鼠共60只,鼠齡為 6～8 周,體質(zhì)量18～22 g,購于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心[動物許可證號：SCXK(蘇)2012-0004]，飼養(yǎng)于弋磯山醫(yī)院中心實驗室，將小鼠隨機(jī)分為3 組：哮喘模型組、辛伐他汀組、對照組，每組20只。小鼠飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。卵蛋白(上海旌雨生科有限公司)，氫氧化鋁粉末(上海旌雨生科有限公司)，辛伐他汀(默沙東制藥有限公司)，RIPA裂解液(碧云天生科有限公司)、PVDF膜(美國sigma公司)，ECL發(fā)光液(美國Thermo Scientific公司)，Trizol總RNA提取試劑盒(碧云天生科有限公司)，PCR試劑盒(上海旌雨生科有限公司)，TGF-β1兔多克隆抗體(上海旌雨生科有限公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生科有限公司)，超聲霧化器(魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)，病理圖像處理分析軟件(Tissue Studio)，實時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Gel-Image-System軟件)。

1.2 構(gòu)建哮喘動物模型 哮喘模型組(以下簡稱哮喘組)：小鼠分別于第1、14天腹腔注射1 mL致敏液(OVA 10 μg+氫氧化鋁凝膠100 μg)；從第21天開始為激發(fā)階段，將小鼠置于霧化吸入箱中，霧化吸入50 g/L的OVA溶液，每次30 min,每周3次,連續(xù)8周；小鼠出現(xiàn)點頭運動、搔鼻、煩躁不安、呼吸急促、兩便失禁為哮喘發(fā)作標(biāo)志。辛伐他汀組：除正常致敏激發(fā)外，每次于激發(fā)前30 min給予辛伐他汀40 mg/kg混懸液腹腔注射。對照組：用生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)，余操作同哮喘組。

1.3 標(biāo)本采集 各組小鼠在最后一次激發(fā)24 h后斷頸處死小鼠，先取右側(cè)肺組織放入凍存管中置于液氮中凍存，用于Real time-PCR及Western blot檢測。取小鼠左側(cè)肺組織置4%多聚甲醛中固定24 h，用于HE染色后病理檢查。

1.4 小鼠肺組織病理及圖像分析鑒定氣道重構(gòu) 多聚甲醛中固定后的肺組織標(biāo)本經(jīng)PBS沖洗、酒精脫水，浸蠟包埋后切片，行HE染色后鏡下觀察各組小鼠肺組織病理形態(tài)，Tissue Studio病理圖像處理分析軟件測量氣道基底膜周徑(perimeter of basement membrane，Pbm)、內(nèi)壁面積(internal wall area，WAi)、平滑肌面積(smooth muscle area，WAm)，支氣管壁厚度及平滑肌層厚度分別以WAi/Pbm(μm2/μm)和WAm/Pbm(μm2/μm)來計算。

1.5 Real time PCR方法檢測小鼠肺組織中TGF-β1mRNA表達(dá) 由上海生工有限公司設(shè)計和合成TGF-β1及內(nèi)參GAPDH引物，序列如表1。

表1 引物名稱和基因序列

引物名稱基因序列TGF?β1?F5′?TGGCGTTACCTTGGTAACC?3′TGF?β1?R5′?GGTGTTGAGCCCTTTCCAG?3′GAPDH?F5′?TGGCCTCCAAGGAGTAAGAAAC?3′GAPDH?R5′?GGCCTCTCTCTTGCTCTCAGTATC?3′

取凍存的肺組織80 mg，總RNA提取(步驟按照Trizol試劑盒說明書)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA(步驟按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書)。以合成的2 μL cDNA為模板，加入上下游引物各1 μL,10 μL SYBR Green熒光染料，6 μL H2O，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。采用2-△△Ct法來計算目的基因的相對表達(dá)量，目的基因的相對表達(dá)量=2-△△Ct。

1.6 Western blot方法檢測肺組織TGF-β1蛋白表達(dá) 將RIPA蛋白裂解液加入肺組織中，置于碎冰上，將標(biāo)本放入勻漿機(jī)中搗碎，將制成的組織勻漿放置冰上30 min,離心后取上清液，-80℃保存。用BCA法測定蛋白濃度，按照4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液，沸水煮使蛋白變性。電泳上樣量為40 μg，5%濃縮膠80 V，30 min，15%分離膠120 V，1 h，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜取出并沖洗，用5%脫牛血清白蛋白室溫封閉，室溫?fù)u床上緩慢搖動2 h；加入兔抗鼠TGF-β1抗體(1∶200)，4℃搖床上緩慢搖動過夜；棄去帶有兔抗鼠TGF-β1抗體的分泌液，將PVDF膜置于搖床上用TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2000)，室溫?fù)u床上緩慢搖動2 h，TBST洗膜10 min，ECL顯影。以GADPH作為內(nèi)參，用Gel-Image-System凝膠成像分析系統(tǒng)分析條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理改變(HE染色) 對照組小鼠的肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，氣道上皮無增厚，無支氣管痙攣，無支氣管狹窄，無炎癥細(xì)胞浸潤(圖1)。哮喘組小鼠的氣道壁明顯增厚，可見大量的炎癥細(xì)胞和黏液分泌，膠原沉積，氣道壁增厚，可見支氣管狹窄(圖2)。與哮喘組相比，辛伐他汀組氣道上皮結(jié)構(gòu)較完整，管腔規(guī)則，有輕度破壞，炎癥細(xì)胞明顯減少，與對照組相比，支氣管周圍仍有輕度破壞，少量炎癥細(xì)胞浸潤(圖3)，可見辛伐他汀組病理改變程度較對照組嚴(yán)重，但較哮喘組減輕。病理圖像處理分析軟件Tissue Studio測量各組小鼠支氣管壁厚度及平滑肌層厚度，哮喘組支氣管壁厚度及平滑肌層厚度最高，辛伐他汀組較對照組高，但較哮喘組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(哮喘組vs.對照組P=0.000，辛伐他汀組vs.對照組P=0.000，哮喘組vs.辛伐他汀組P=0.000)，見表2。

圖1對照組肺組織病理(HE染色 ×200)

圖2 哮喘組肺組織病理(HE染色 ×200)

圖3 辛伐他汀組肺組織病理(HE染色 ×200)

組別例數(shù)WAi/Pbm/(μm2/μm)WAm/Pbm/(μm2/μm)TGF?β1mRNATGF?β1蛋白對照組2025．08±1．4115．07±1．190．94±0．250．52±0．07哮喘組2089．25±4．4943．49±3．553．40±0．670．89±0．16辛伐他汀組2058．63±2．1723．95±2．641．85±0．380．68±0．03F2301．43604．32141．5465．80P0．0000．0000．0000．000

2.2 各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA表達(dá) 哮喘組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA水平最高，對照組最低，辛伐他汀組高于對照組，但較哮喘組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(哮喘組vs.對照組P=0.003，辛伐他汀組vs.對照組P=0.023，哮喘組vs.辛伐他汀組P=0.010)。見表2。

2.3 各組小鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá) 哮喘組小鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)水平最高，對照組最低，辛伐他汀組高于對照組，但較哮喘組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(哮喘組vs.對照組P=0.013，辛伐他汀組vs.對照組P=0.042，哮喘組vs.辛伐他汀組P=0.030)。見表2、圖4。

圖4 各組小鼠肺組織中TGF-β1蛋白表達(dá)

3 討論

氣道重構(gòu)是繼呼吸道慢性炎癥后研究者們最為關(guān)注的支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制[6]，氣道重構(gòu)的主要改變體現(xiàn)在氣道壁的增厚、氣道壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、氣道動力出現(xiàn)滯緩或僵硬[7-8]。目前研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1與哮喘疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。一方面，TGF-β1與炎癥應(yīng)答密切相關(guān)，同時具有抗炎癥作用與促炎癥作用[9-10]。另一方面，TGF-β1是體內(nèi)重要的促纖維化細(xì)胞因子，參與纖維化，對細(xì)胞的增殖和分化過程起著重要作用，其過度表達(dá)與哮喘的氣道重構(gòu)密切相關(guān)[11]。辛伐他汀是他汀類降血脂藥物，臨床上一直用于控制血液中膽固醇的含量。國外研究證實辛伐他汀可以抑制膠原纖維增生，從轉(zhuǎn)錄水平抑制TGF-β1，通過降低血液中TGF-β1水平，可用于治療骨關(guān)節(jié)炎和糖尿病腎病，但對哮喘氣道重塑的影響研究較少。實驗證實辛伐他汀還具有減少氣道內(nèi)黏液腺體的分泌，阻止氣道上皮杯狀細(xì)胞增生和肥大，抑制血管和氣道平滑肌增生的作用[12]。

目前有研究顯示辛伐他汀可以降低哮喘急性發(fā)作患者血清TGF-β1水平，從而發(fā)揮抑制氣道重塑的作用，但對肺組織中TGF-β1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)研究較少。本研究中，應(yīng)用OVA致敏小鼠構(gòu)建小鼠哮喘模型，肺組織病理示氣道黏膜破壞，杯狀細(xì)胞表達(dá)增加，可見基底膜增厚，平滑肌細(xì)胞增殖，氣道壁及平滑肌明顯增厚，同時可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤；結(jié)合圖像分析證實哮喘組支氣管壁厚度及平滑肌層厚度最高，辛伐他汀組較對照組高，但較哮喘組降低，可見辛伐他汀組病理改變程度較對照組嚴(yán)重，但較哮喘組減輕。本實驗還檢測各組小鼠肺組織TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)，得出哮喘組TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)最高，對照組TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)最低，辛伐他汀組表達(dá)水平高于對照組，但較哮喘組降低，結(jié)果證明辛伐他汀通過降低肺組織TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)實現(xiàn)抑制哮喘氣道重構(gòu)作用，其機(jī)制有可能是辛伐他汀抑制了Ras蛋白活化，從而阻斷Ras-MAPK信號通路級聯(lián)激活[13]，最終抑制TGF-β1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，下一步我們將進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)一步通過抑制實驗探究Ras-MAPK信號通路與TGF-β1介導(dǎo)的氣道重塑的關(guān)系。Mckay等[14]研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射和口服不同劑量的辛伐他汀均可降低血清中TGF-β1水平，但腹腔注射效果較口服給藥好，且具有劑量依賴性。目前辛伐他汀對肺組織中TGF-β1水平的影響是否有劑量-效應(yīng)關(guān)系，且是否與給藥方式、給藥時間有關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。

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