軟骨發(fā)育不全1例臨床特點(diǎn)及其基因突變分析

張亞妹，萬乃君，孫慧慧

軟骨發(fā)育不全(achondroplasia，ACH)是一種先天性軟骨發(fā)育異常性疾病，屬于常染色體顯性遺傳疾病，80%為散發(fā)病例。其主要臨床表現(xiàn)為短肢型侏儒癥，表現(xiàn)為不成比例的身材短小、巨顱、前額突出、面中部發(fā)育不良、“三叉手”、關(guān)節(jié)過伸、腰椎過度前突等，智力一般都正常[1]，壽命接近正常人。此病于1878年首次報(bào)道[2]，發(fā)病率1/10000-30000活產(chǎn)嬰兒[3]，全世界大約有25萬人罹患此病,男女比例無差別。一般最終的成年身高男性為(131±5.6)cm，女性為(124±5.9)cm[4, 5]。成纖維細(xì)胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3, FGFR3)基因是ACH的重要致病基因，外顯率100%，絕大多數(shù)為雜合突變，1138位核苷酸點(diǎn)突變是為最常見的突變，約90%為1138G>A，余不到10%G>C[6-8]，此外1123G>T(G375C)突變也報(bào)道過[9]。我院收治一例ACH患者的臨床資料，對(duì)患兒進(jìn)行遺傳性骨病的Ⅱ代測(cè)序，確定本患兒是否存在FGFR3基因突變，結(jié)合患兒臨床特點(diǎn)及基因突變表型。

1 病例報(bào)告

1.1 一般情況 患兒，男，1歲6個(gè)月，因“生長遲緩1年6月”于2017在北京積水潭醫(yī)院兒科門診就診，對(duì)患兒及父母建立臨床資料信息登記表、簽署知情同意書，并收集患兒及其父母外周血DNA。患兒男，G1P1，孕41周，因頭盆不稱剖宮產(chǎn)出生，出生體重3900 g，出生身長50 cm，入院查體：身長71.7 cm(p<3 th)，體重10.3 kg(p10-25 th)，頭圍52 cm(p>97 th)，上部量占身長的60%，下部量占身長的40%，自小身高較同齡人矮，頭大，四肢短粗，鼻梁塌陷，睡眠打鼾伴呼吸困難，“三叉手”，腰椎過度前突，臀部后翹，下肢彎曲畸形，智力正常?；純焊改笧榉墙H結(jié)婚，體型外貌無異常，家族中無特殊疾病。

1.2 輔助檢查

1.2.1 X線檢查 左手左腕正位骨齡大致相當(dāng)于1.5歲左右，雙手尺橈骨干骺端增寬(圖1)。胸腰段部分腰椎改變，胸腰椎椎體不規(guī)則變扁，腰骶角增大，代謝性骨病(圖2)。

圖1 左手左腕正位骨齡片

圖2 脊柱

1.2.2 血液樣本采集和DNA提取 收集患者及其父母的外周血。

1.2.3 二代測(cè)序 從受檢者外周血中提取基因DNA，構(gòu)建基因組文庫，然后通過探針雜交捕獲與遺傳性骨病相關(guān)基因的外顯子及相鄰內(nèi)含子區(qū)域(50 bp)，并進(jìn)行富集，富集的目的基因片段通過下代高通量測(cè)序儀(Illumina)進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序數(shù)據(jù)運(yùn)用Next Gene V2.3.4軟件與UCSC數(shù)據(jù)庫提供的人類基因組 hg19 參考序列進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度和測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。依據(jù)嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)變異進(jìn)行過濾，并添加HGMD數(shù)據(jù)庫、蛋白功能預(yù)測(cè)軟件的相關(guān)注釋信息，對(duì)明確或可能與受檢者臨床表型相關(guān)的基因變異，采用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，上述檢測(cè)均由北京信諾佰世醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所完成。

1.3 結(jié)果 對(duì)患者及其父母進(jìn)行基因分析，檢測(cè)受檢者與遺傳性骨病相關(guān)的473個(gè)基因，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，確定了可能的突變基因，并對(duì)受檢者及其父母進(jìn)行一代測(cè)序驗(yàn)證。突變位點(diǎn)及其臨床意義的詳細(xì)信息如下：

1.3.1 遺傳學(xué)意義 本研究在患兒FGFR3基因發(fā)現(xiàn)c.1138G>A/(p.G380R)雜合突變，為HGMD報(bào)道的已知致病性突變。未發(fā)現(xiàn)受檢者父母攜帶上述突變，因此推測(cè)該突變?yōu)樾律蛔儯慌懦改复嬖谏臣?xì)胞嵌合體的可能，具體見測(cè)序圖(圖3)。

1.3.2 測(cè)序圖 一代驗(yàn)證結(jié)果 FGFR3基因c.1138G>A(p.G380R)雜合突變，未在受檢者父母外周血中檢測(cè)到。

圖3 反向測(cè)序結(jié)果

2 討 論

ACH是一種常見的軟骨發(fā)育異常，其發(fā)生率在軟骨發(fā)育異常中最高，且發(fā)現(xiàn)較早。ACH的患兒表現(xiàn)為四肢短小，軀干相對(duì)細(xì)長，伴有巨顱，前額突出，面中部發(fā)育不良，“三叉手”，關(guān)節(jié)過伸，腰椎過度前突等異常?；純旱闹w遠(yuǎn)端受累會(huì)輕于近端，表現(xiàn)為脛腓骨及尺饒受累較股骨及肱骨輕。隨著患兒年齡的增長，這種差異會(huì)更加顯著，形成特殊的畸形，稱為侏儒畸形。對(duì)ACH患者的研究，發(fā)現(xiàn)所有患者均為成纖維細(xì)胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3, FGFR3)基因編碼的基因FGFR3突變所致。FGFR3屬于成纖維細(xì)胞生長因子受體家族成員之一，是一種具有調(diào)節(jié)生長發(fā)育等功能的跨膜蛋白。FGFR3基因位于4p16.3上，此基因長度約為16.5 kb，有19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子，其中第10外顯子編碼FGFR3跨膜區(qū)[10]，含有806個(gè)氨基酸殘基，由胞外區(qū)，疏水跨膜區(qū)，胞內(nèi)酪氨酸激酶活性區(qū)3部分組成。FGFR3為無活性單體，與成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)2、4、9結(jié)合后，聚合為二聚體，激活胞內(nèi)區(qū)酪氨酸激酶活性，使其酪氨酸殘基磷酸化，啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)通路?，F(xiàn)研究FGFR3主要是通過激活信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activator of transcription, STAT)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路發(fā)揮作用，STAT1通路抑制軟骨細(xì)胞增殖，MAPK通路抑制軟骨細(xì)胞向肥大細(xì)胞分化[11]，其通過抑制軟骨細(xì)胞增生分化，抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成及促進(jìn)其降解而發(fā)揮骨骼生長調(diào)節(jié)作用[12]。但生理情況下FGFR3活化后會(huì)被迅速泛素化，隨后被蛋白酶體降解，信號(hào)傳導(dǎo)隨即終止，從而調(diào)節(jié)軟骨的成骨。但ACH患兒，由于FGFR3基因1138位核苷酸點(diǎn)突變G>A，該突變導(dǎo)致了甘氨酸置換成精氨酸，使跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)改變，影響蛋白功能，這種改變會(huì)增強(qiáng)酪氨酸活性，干擾泛素化反應(yīng)，延緩蛋白酶體的降解，延長傳導(dǎo)時(shí)間，從而增強(qiáng)了FGFR3對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和分化的負(fù)性調(diào)節(jié)作用,干擾了軟骨內(nèi)成骨[13]，而軟骨內(nèi)成骨是長骨線性生長的主要方式[14]。不僅FGFR3基因1138G>A突變會(huì)改變跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)，1138G>C突變、1123G>T突變均會(huì)改變跨膜結(jié)構(gòu)，干擾軟骨成骨。本研究我們報(bào)道的1例ACH患者，臨床表現(xiàn)為身高較同齡人矮，頭大，四肢短粗，鼻梁塌陷，睡眠打鼾伴呼吸困難，“三叉手”、腰椎過度前突，臀部后翹，下肢彎曲畸形。外觀表現(xiàn)典型，進(jìn)一步對(duì)其骨骼系統(tǒng)的致病基因捕獲，患兒攜帶ACH的常見基因FGFR3突變，基因1138位核苷酸點(diǎn)突變G>A，為ACH最常見突變類型。ACH雖為常染色體顯性遺傳，外顯率100%，但實(shí)際卻多為散發(fā)病例報(bào)道。我們報(bào)道的病例，其父母表型均正常。Fryns等[15]認(rèn)為，此種現(xiàn)象可能由新生突變或生殖細(xì)胞嵌合突變所致(嵌合突變即一方的生殖細(xì)胞存在正常和突變兩種細(xì)胞)。另一方面散發(fā)原因與罹患者因自身疾病終身未婚或婚后未生育，導(dǎo)致致病基因沒有了下一代延續(xù)有關(guān)。因此建議有家族史或生育過ACH患兒的父母如再次生育仍需進(jìn)行產(chǎn)前監(jiān)測(cè)并完善基因?qū)W檢測(cè)。目前有報(bào)道ACH致病基因其實(shí)多來自父親，與父親年齡呈相關(guān)性。因?yàn)槟行跃有纬珊蟪掷m(xù)終身，隨著男性年齡的增長，在反復(fù)增殖與分化的過程中，攜帶突變的精原細(xì)胞及精子的比例逐漸升高，因此ACH的發(fā)生會(huì)隨著父親年齡風(fēng)險(xiǎn)成倍增長[16]。此例患兒母親28歲，父親32歲，父親年齡較大，結(jié)合我國目前國情，我國剛剛進(jìn)入二胎全面放開時(shí)期，高齡父母將成倍增多，ACH的發(fā)病率可能會(huì)上升。

ACH的患者智力水平、壽命、性發(fā)育和常人基本相同，但他們生活質(zhì)量卻很低。除了短身材帶來的身心問題之外，多系統(tǒng)骨骼的異常導(dǎo)致的相關(guān)并發(fā)癥才是影響生活質(zhì)量的主要原因。例如頭頸頜面骨骼發(fā)育畸形，造成了解剖學(xué)上氣道的狹窄，狹窄的氣道可導(dǎo)致反復(fù)地呼吸道及中耳的感染，反復(fù)的中耳炎又會(huì)引起聽力的下降，甚至耳聾的發(fā)生[17]，一部分病例甚至發(fā)生聽力受損后的繼發(fā)言語延遲。腦積水也是ACH的常見并發(fā)癥，它是由于顱頸交接區(qū)狹窄導(dǎo)致腦室擴(kuò)大，腦脊液過度分流所致，臨床常表現(xiàn)頭圍增大。脊柱方面的畸形也較多，包括齒突發(fā)育不良、枕骨大孔狹窄、椎弓根短小、椎體扁平、椎管狹窄、胸腰段后凸、脊柱側(cè)突等[18]，并且脊柱畸形隨生長而進(jìn)展，這樣脊髓腔壓力可逐漸增高導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)受壓病變，臨床上就會(huì)逐漸出現(xiàn)肢體的麻木疼痛、感覺異常、進(jìn)行性肌肉張力減退，行走障礙和大小便失禁。嬰兒猝死是最嚴(yán)重的并發(fā)癥。ACH嬰兒猝死發(fā)生率比普通孩子增加6倍[19]，1歲之內(nèi)嬰兒被報(bào)道的病例可達(dá)到7.5%[20]。它的發(fā)生是由于患兒腦干脊髓受壓、頜面發(fā)育異常、扁桃體肥大及腺樣體肥大協(xié)同作用。四肢的成角畸形在整個(gè)生長發(fā)育期會(huì)一直存在，因此對(duì)于ACH患兒我們需要更關(guān)注他并發(fā)癥的預(yù)防和治療，改善其生活質(zhì)量。本例患兒頭大，鼻梁塌陷，夜間打鼾伴呼吸困難，提示患兒可能存在腦積水及呼吸道梗阻問題，在我們進(jìn)一步的隨訪中需要定期監(jiān)測(cè)呼吸功能，及時(shí)干預(yù)盡量減少并發(fā)癥對(duì)其生活影響。

目前關(guān)于ACH尚無有效治療手段，仍是控制癥狀和減輕并發(fā)癥的后果，2014年曾評(píng)估了他汀類藥物對(duì)骨骼生長的作用，其可能通過對(duì)軟骨細(xì)胞的合成代謝作用來刺激骨生長[21-23]，但具體機(jī)制尚不清楚，可能與他汀類藥物會(huì)加速FGFR3的降解有關(guān)[24, 25]。目前雖有大量關(guān)于他汀類藥物在人體內(nèi)使用的數(shù)據(jù)，但人們對(duì)于兒童的用藥安全仍不確定，需要進(jìn)一步臨床研究證實(shí)。另一方法用于暈動(dòng)病的非處方抗組胺藥物美克洛嗪在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也取得一定效果，治療的小鼠骨生長有所改善[26]，但機(jī)制也尚不明確。利鈉肽類似物C型鈉尿肽類似物(C type-natriuretic peptide, CNP)、FGFR3誘變因子(sFGFR3)，一種12氨基酸多肽(P3)及小分子針對(duì)酪氨酸激酶等藥物也在研究階段。這些方法均為以后的治療提出了新的希望，也是目前研究的熱點(diǎn)，這些治療可能可以預(yù)防ACH各種并發(fā)癥的發(fā)生。目前通過產(chǎn)前診斷阻止重癥患兒出生是首選的預(yù)防措施。對(duì)于正常的孕婦來說，超聲仍是診斷的主要方法，孕晚期超聲通過判斷股骨、肱骨長度，臨床把長度<2SD，或低于相應(yīng)孕周參考值的第5百分位[27],同時(shí)可伴有雙頂徑與孕周不相符，三叉手，面中塌陷及羊水量增多等異常輔助診斷[28]作為篩檢對(duì)象；但其局限性是一般確診都在孕晚期或出生后。因此建議一方或雙方ACH患者或曾生育過ACH患兒的家庭，在孕早、中期通過侵入性產(chǎn)前檢查FGFR3基因進(jìn)行早期診斷，F(xiàn)GFR3基因熱點(diǎn)的檢測(cè)仍是目前對(duì)胎兒早期確診的最直接最有效的檢測(cè)。

綜上所述ACH是一種常染色體顯性遺傳病，是由于FGFR3基因突變所致，絕大多數(shù)突變是1138G>A突變，少數(shù)是1138G>C突變。它臨床導(dǎo)致多系統(tǒng)骨骼異常并伴有多種并發(fā)癥，目前對(duì)于ACH尚無有效治療方法，因此產(chǎn)前篩查對(duì)于預(yù)防此病和早期診斷至關(guān)重要，建議對(duì)高危人群需及時(shí)進(jìn)行FGFR3基因熱點(diǎn)檢測(cè)。

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