雪松松針總黃酮的體外抗腫瘤作用

郝凱華 胡鵬斌 韓 宇 韓 濤

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

松科植物雪松松針富含黃酮類化合物〔1〕。松針性溫、味苦，入肝、腎、脾經(jīng)，具祛風(fēng)活絡(luò)、活血止血、消腫生肌之功效，能治濕瘡，安五臟〔2〕?，F(xiàn)代研究表明雪松具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌等多種藥理活性〔3〕。我國(guó)雪松松針資源豐富，分布廣泛，極易采收，可再生。此外，研究證實(shí)黃酮類化合物抗腫瘤藥理活性廣泛，作用于腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)〔4～6〕，具良好抗腫瘤作用，是一類值得深入挖掘并具開(kāi)發(fā)價(jià)值的物質(zhì)〔7,8〕，目前尚未見(jiàn)雪松松針總黃酮(TFCD)抗腫瘤活性研究報(bào)道。本文觀察TFCD的體外抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1藥品、材料與儀器 TFCD由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所提供(純度：54.28%)。人宮頸癌HeLa細(xì)胞株(蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院)，人胃癌細(xì)胞株MKN28(蘭大二院消化系腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，人肺癌細(xì)胞株A549及人肝癌細(xì)胞株HepG2(甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心)，人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨研所)。RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone)，胎牛血清(FBS，上海尚寶生物科技有限公司)，RnaseA，5-氟尿嘧啶(5-FU，上海銳聰科技發(fā)展有限公司)，PI細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。X-mark酶標(biāo)儀(BioRad公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson公司)。

1.2MTT法檢測(cè)TFCD對(duì)5種腫瘤細(xì)胞增殖的影響 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa、MKN28、A549、HepG2及SHG44細(xì)胞，消化，制備濃度為2.5×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種到96孔板中，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h，加藥，使藥物終濃度分別為0、5、10、20、30、40、50、60、80、100 μg/ml。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，各孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，棄掉培養(yǎng)孔中液體，每孔加入150 μl DMSO完全溶解紫色結(jié)晶，于570 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算增殖抑制率。

1.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)TFCD對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響〔9〕取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別加入終濃度為0、10、20、40、80、160 μg/ml的TFCD藥液，培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)液，消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞，清洗細(xì)胞2次，于70%乙醇中4℃條件下固定，過(guò)夜，次日除去70%乙醇，清洗細(xì)胞2次，加入100 μl RnaseA(濃度100 μg/ml)，37℃水浴30 min，加入400 μl PI(100 μg/ml)，4℃避光染色30 min后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.4Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)TFCD對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響〔9〕將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，消化，接種于6孔板中，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度分別為0、10、20、40、80、160 μg/ml的TFCD，37℃ 5%CO2培養(yǎng)48 h后，消化收集細(xì)胞，洗滌細(xì)胞2次，收集5×105個(gè)細(xì)胞，400 μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC，5 μl PI，混勻后，室溫、避光、反應(yīng)15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(Ex=488 nm;Em=530 nm)細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)學(xué)觀察 與空白對(duì)照組比較，加入不同濃度藥物后，A549、HepG2及SHG44細(xì)胞形態(tài)由規(guī)則菱形和梭形逐漸變圓，連接逐漸消失，數(shù)目減少，增殖活力顯著下降。HeLa、MKN45細(xì)胞數(shù)目逐漸增加，細(xì)胞間連接致密。

2.2MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖抑制率 不同濃度TFCD作用于HeLa和MKN45細(xì)胞48 h，TFCD≥60 μg/ml時(shí)，對(duì)HeLa細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用(P<0.05)。TFCD≥40 μg/ml時(shí)，對(duì)MKN45細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，且有量-效關(guān)系(P<0.05)。不同濃度TFCD作用于A549、HepG2和SHG44細(xì)胞48 h后，均有增殖抑制作用，其中對(duì)A549、HepG2細(xì)胞抑制作用有量-效關(guān)系(P<0.05)，其IC50分別為211.39 μg/ml和114.12 μg/ml，當(dāng)TFCD濃度為100 μg/ml時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率為(50.94±6.11)%。見(jiàn)表1。

表1 TFCD對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制率的影響

-：TFCD對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖無(wú)抑制作用；與本組細(xì)胞前一濃度組比較：1)P<0.05

2.3TFCD對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響 隨TFCD濃度增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增高，S期及G2/M期的細(xì)胞比例降低。當(dāng)TFCD為40 μg/ml和80 μg/ml時(shí)，與空白對(duì)照組相比阻滯作用顯著(P<0.05)；當(dāng)TFCD為160 μg/ml時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例與空白對(duì)照組相比具極顯著差異(P<0.01)；表明TFCD能夠影響HepG2腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程，使其停滯于G0/G1期，且此作用具有濃度依賴性。見(jiàn)表2。

表2 TFCD對(duì)HepG2細(xì)胞周期影響

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4TFCD對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度TFCD作用于HepG2細(xì)胞48 h后隨著TFCD濃度的增加，HepG2細(xì)胞凋亡率逐漸升高。當(dāng)藥物濃度為10、20 μg/ml時(shí)凋亡率為(8.32±0.94)%、(12.71±1.29)%，與空白對(duì)照組〔(8.72±1.69)%〕相比誘導(dǎo)凋亡作用顯著(P<0.05)；當(dāng)濃度為40、80、160 μg/ml時(shí)，凋亡率分別為(20.53±2.07)%、(33.86±1.17)%、(64.56±2.05)%，與空白對(duì)照組有極顯著差異(P<0.01)，表明TFCD能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，且此作用具有濃度依賴性。

3 討 論

研究證實(shí)黃酮類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制及促凋亡作用〔10,11〕，本研究結(jié)果顯示TFCD能夠體外抑制不同腫瘤細(xì)胞增殖，并具劑量依賴性，但該作用較平緩。腫瘤細(xì)胞增殖受到細(xì)胞周期調(diào)控，若其周期調(diào)控紊亂，則可導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖，G0/G1期對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控及增殖起著極為關(guān)鍵作用，正常機(jī)體細(xì)胞因受到嚴(yán)格細(xì)胞周期調(diào)控、啟動(dòng)、監(jiān)控，從而有節(jié)制增殖。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是抑制腫瘤發(fā)展的重要手段之一〔12～14〕。本研究發(fā)現(xiàn)，隨TFCD濃度升高，HepG2細(xì)胞停滯于G0/G1期比例呈增加趨勢(shì)，凋亡率亦逐漸升高，并呈現(xiàn)劑量依賴性。本研究與何光志等〔15〕運(yùn)用皂角刺總黃酮，選用HepG2細(xì)胞進(jìn)行體外抗腫瘤研究，不同濃度皂角刺總黃酮作用48 h后，能顯著抑制并誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖及凋亡，并隨給藥濃度增加作用增強(qiáng)。

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