蠅蛆肽對(duì)衰老小鼠的抗氧化作用

趙春江 魏 洪 夏冰天 文 雪 李俞亭 佘曉玲

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025)

研究安全又經(jīng)濟(jì)的天然抗氧化劑替代不安全的化學(xué)抗氧化劑已成為一大熱點(diǎn)〔1〕。而在食品業(yè)、藥業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的天然生物活性肽，具有高效、低毒、無(wú)污染等特點(diǎn)〔2〕。家蠅(Musca domestica L)幼蟲(chóng)體內(nèi)具有抗氧化活性的蛋白質(zhì)〔3，4〕，本研究以家蠅幼蟲(chóng)為原料通過(guò)40%固相萃取制備蠅蛆肽〔5〕，通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)蠅蛆肽具有抗腫瘤作用，可清除S180小鼠體內(nèi)的自由基〔6〕，本文探討蠅蛆肽對(duì)D-半乳糖(D-gal)致衰老模型小鼠的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 昆明種3月齡小鼠60只，雌雄各半，體重(33.13±2.66)g，均由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(黔)2012-0001；家蠅：由貴州醫(yī)科大學(xué)感染與免疫實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)傳代，幼蟲(chóng)飼養(yǎng)參考文獻(xiàn)〔7〕；蠅蛆肽的制備：取3日齡家蠅幼蟲(chóng)，制備方法參照文獻(xiàn)〔5〕；D-gal購(gòu)自GENVIEW公司，批號(hào)4304020140)；維生素C片購(gòu)自東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司(批號(hào)5131035)；蛋白定量測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SJIA-10N冷凍干燥機(jī)(寧波市雙嘉儀器有限公司)；SC-2546低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；UV-1200紫外分光光度計(jì)(上海美析儀器有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備〔8，9〕及給藥方法 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(K組)，模型組(A組)，維生素C組(V組)，蠅蛆肽低、中、高劑量組(L組、M組、H組)，每組10只。除K組頸背部注射生理鹽水外，其余組均采用頸背部每日皮下注射D-gal溶液100 mg/kg，K組注射同劑量的生理鹽水。L、M、H組分別每天1次灌胃蠅蛆肽50、100、200 mg/kg，V組每天1次灌胃維生素C 100 mg/kg。實(shí)驗(yàn)期間觀察小鼠的外觀變化及每周測(cè)一次體重，7 w后處死小鼠，測(cè)定各項(xiàng)抗氧化指標(biāo)。

1.3指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱(chēng)量小鼠體重。摘眼球采血，離心取血清并用于檢測(cè)SOD和CAT活性及MDA含量。采集腦、胸腺、肝臟和脾臟并稱(chēng)重，計(jì)算小鼠肝臟、胸腺和脾臟指數(shù)。肝臟和腦組織各取0.1～0.2 g制備10%肝臟組織勻漿和10%腦組織勻漿，小鼠肝臟組織和腦組織SOD、CAT及GSH-Px活性和MDA含量采用試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組外觀特征及體重 連續(xù)皮下注射D-gal 7 w后，L、M、H組和K組毛色有光澤，活潑易動(dòng)，精神狀態(tài)良好；A組則表現(xiàn)出毛色失去光澤，行動(dòng)緩慢，反應(yīng)遲鈍等一系列體征。試驗(yàn)期間，所有給藥組動(dòng)物一般狀態(tài)良好，L、M、H組體重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明蠅蛆肽對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響，見(jiàn)表1。

表1 各組實(shí)驗(yàn)期間體重比較

2.2各組臟器指數(shù) 與K組比較，A組胸腺、脾和肝臟指數(shù)均顯著降低(P<0.01)；與A組比較，L、M、H、V組胸腺、肝臟指數(shù)均升高(P<0.05或P<0.01)，與A組比較，M、H、V組脾指數(shù)升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組臟器指數(shù)比較

與K組比較：1)P<0.01；與A組比較:2)P<0.05，3)P<0.01；表4同

2.3各組血清、肝臟和腦組織中SOD活力比較 與K組比較，A組血清、肝臟和腦組織中SOD含量顯著降低(P<0.01)。與A組比較，L、M、H、V組肝臟和腦組織中SOD活性升高(P<0.05或P<0.01)，M、H、V組血清中SOD活性升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4各組血清、肝臟和腦組織中MDA含量 與K組比較，A組血清、肝臟和腦組織中MDA含量顯著升高(P<0.01)。與A組比較，L、M、H、V組血清、肝臟和腦組織中MDA含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表4。

表3 各組血清、肝臟和腦組織中SOD活力比較

與K組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與A組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

2.5各組血清、肝臟和腦組織中CAT活力 與K組比較，A組血清、肝臟和腦組織中CAT活性顯著降低(P<0.01)，與A組比較，L、M、H、V組血清和肝臟組織中CAT活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)，M、H、V組腦組織中CAT活性顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.6各組肝臟和腦組織中GSH-Px活力 與K組比較，A組肝臟和腦組織中GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01)，與A組比較，L、M、H、V組肝臟組織中GSH-Px活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)，M、H、V組腦組織中GSH-Px活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 各組血清、肝臟和腦組織中MDA、CAT、GSH-Px含量

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用在抗衰老研究中應(yīng)用廣泛的D-gal衰老模型，該模型不僅衰老變化明顯，又較成熟穩(wěn)定〔10,11〕。自由基的損傷在衰老機(jī)制的研究中被廣泛接受〔12〕。機(jī)體在正常生理情況下，其抗氧化防御系統(tǒng)的完整能防止自由基反應(yīng)和阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化物形成，從而維持生成與清除的動(dòng)態(tài)平衡〔13〕。

胸腺和脾臟是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官，前者位于機(jī)體中樞，后者位于機(jī)體外周，兩者均能產(chǎn)生與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的活性物質(zhì)，因此，兩者的功能和狀態(tài)直接影響機(jī)體的免疫功能〔14～16〕，積累的自由基會(huì)損傷機(jī)體內(nèi)重要的肝臟，其為機(jī)體內(nèi)代謝和解毒器官。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，各個(gè)劑量的蠅蛆肽組與模型組相比，均能不同程度提高胸腺、脾臟和肝臟指數(shù)，與文獻(xiàn)中報(bào)道的蠶蛹多肽對(duì)D-gal衰老小鼠的作用效果相似〔17〕，體現(xiàn)出蠅蛆肽具有作為提高機(jī)體免疫力保健品的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

SOD作為專(zhuān)一清除超氧陰離子自由基的抗氧化物酶，對(duì)維持機(jī)體氧化與抗氧化平衡有重要意義，其活力間接反映機(jī)體清除自由基的能力〔18,19〕。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物之一，可進(jìn)一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián)，使細(xì)胞脆性增加和變形性降低，從而導(dǎo)致生物膜結(jié)構(gòu)和功能改變〔20〕。研究表明黃緣盒龜多肽能提高SOD活性并降低MDA 含量〔21〕，與本試驗(yàn)中、高劑量蠅蛆肽實(shí)驗(yàn)效果相似，說(shuō)明蠅蛆肽具有清除機(jī)體內(nèi)自由基、對(duì)抗自由基損傷引起的機(jī)體衰老過(guò)程的能力。

GSH-Px通過(guò)特異性的催化還原型GSH，阻斷過(guò)氧化物的還原反應(yīng)，防止過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞膜及機(jī)體的損害。廣泛存在于機(jī)體中的CAT具有重要的生理學(xué)功能并保護(hù)細(xì)胞〔20，22〕。GSH-Px和CAT可保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，均是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化物酶，對(duì)H2O2分解起到催化作用〔23〕。包怡紅等〔24〕試驗(yàn)表明乳清蛋白肽能提高小鼠GSH-Px和CAT活性，本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明蠅蛆肽具有和乳清蛋白肽相似的作用，催化H2O2生成無(wú)毒的H2O和O2，拮抗自由基對(duì)機(jī)體的損傷。以上結(jié)果提示，蠅蛆肽可能通過(guò)提高SOD、CAT、GSH-Px活性，增強(qiáng)對(duì)自由基的清除能力，降低MDA含量，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，從而延緩衰老。

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