老年肺癌晚期酪氨酸激酶抑制劑治療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞亞群的相關(guān)性

涂長(zhǎng)玲 江 波 金從國(guó) 何文杰 朱 穎

(昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 云南省腫瘤醫(yī)院干部醫(yī)療科，云南 昆明 650118)

肺癌是我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，約有 50%的患者年齡在 65 歲以上〔1〕。含鉑雙藥化療在晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)一線治療領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)地位已經(jīng)確立，同時(shí)也達(dá)到了其療效平臺(tái)〔2，3〕。對(duì)于>65歲或體力狀態(tài)(PS)評(píng)分>2分的老年NSCLC患者，化療往往會(huì)引起嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，不能耐受?；熢跉[瘤細(xì)胞同時(shí)，也對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞造成破壞和殺傷，使得患者的免疫功能受到損傷〔4〕，對(duì)療效產(chǎn)生不利的影響。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)突變型患者對(duì)EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(TKI)類藥物的有效率可達(dá)65%～83%，且副作用輕耐受性好，EGFR-TKI類藥物已成為老年EGFR突變晚期NSCLC的一線治療藥物。目前利用外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)檢測(cè)EGFR突變已成為肺癌領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)〔5，6〕。經(jīng)過(guò)TKI治療后患者細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)及細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能得以改善〔7〕，但外周血CTC與細(xì)胞免疫功能相關(guān)性尚未明確。本研究以晚期老年NSCLC為研究對(duì)象，以外周血CTC為載體，旨在探討CTC表達(dá)與T細(xì)胞亞群、自然殺傷(NK)細(xì)胞及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 云南省腫瘤醫(yī)院2012年9月至2014年5月收治且經(jīng)病理組織學(xué)診斷的晚期NSCLC患者66例，其中男40例，女26例，年齡65～78歲，中位年齡68歲，病理類型：腺癌58例，鱗癌8例。TNM分期：ⅢB期4例，Ⅳ期62例，ECOG標(biāo)準(zhǔn)PS評(píng)分0～3分。治療前后均行胸腹部CT、彩超、顱腦磁共振成像(MRI)、心電圖，血常規(guī)、血生化及腫瘤標(biāo)志物檢查，預(yù)計(jì)生存在3 個(gè)月以上，心、肝、腎功能基本正常，無(wú)免疫系統(tǒng)疾病。

1.2治療方法 隨機(jī)從以下3種EGFR-TKI類藥物中任選一種。吉非替尼片(阿斯利康公司生產(chǎn))使用劑量為每次250 mg，口服，1次/d；厄洛替尼片(美國(guó)羅氏公司生產(chǎn))使用劑量為每次150 mg，口服，1次/d；鹽酸?？商婺崞?浙江貝達(dá)藥業(yè)公司生產(chǎn))使用劑量為每次125 mg，口服，3次/d。無(wú)論選擇何種藥物均至少服用1個(gè)月。

1.3標(biāo)本采集 所有患者在治療前先從肘正中靜脈中抽血5 ml，加入肝素抗凝混勻，并在采集后2 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4抗體及試劑 CD45-PC5、CK18-FITC、EGFR-PE、NH4Cl溶血素，均購(gòu)于美國(guó)Beckman coulter公司。流式細(xì)胞儀EPICS XL(美國(guó)Beckman coulter公司)。

1.5分選CD45-CK18+細(xì)胞 將外周血20 ml分成20份加入5 ml的無(wú)菌試管中，每管1 ml；每管均加入CD45-PC5、CK18-FITC各200 μl(按標(biāo)準(zhǔn)100 μl外周血加入20 μl的試劑量)，避光保存30 min；加入NH4Cl溶血素4 ml，反復(fù)溶血，直到液體透亮，離心后加入培養(yǎng)液待分選；消毒ALTRA流式室，調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度到8℃左右，開機(jī)，換上偏振板，進(jìn)入SORT界面，調(diào)整Freq、Drive參數(shù)，上Flow-Check，找到分選時(shí)的Delay，打開檢測(cè)CD45-CK18+的方案中以FS PEAK為閾值，在SORT功能，按Receive，接受上面的分選參數(shù)，確定檢測(cè)后，設(shè)置SORT的左右收集細(xì)胞群，一般左邊為CD45-CK18+細(xì)胞，右邊為非CD45-CK18+細(xì)胞，收集數(shù)目根據(jù)要求設(shè)置，同時(shí)在樣本收集處安裝收集試管，上分選試管，開始收集細(xì)胞，收集過(guò)程中需要全程振蕩，同時(shí)每30 min需要觀察。分選CD45-CK18+細(xì)胞近1 000個(gè)就可以結(jié)束。

1.6流式細(xì)胞測(cè)定 各采集TKI治療前1 d及治療1個(gè)月后1 d清晨外周血5 ml，T細(xì)胞亞群檢測(cè)：肝素抗凝的全血100 μl，加入10 μl CD45-FITC/CD4-RD/CD8-ECO/CD3-P15；NK細(xì)胞檢測(cè)：肝素抗凝的全血100 μl，加入20 μl CD45-PC5/CD3/CD16+56-PE。上述標(biāo)本室溫避光靜置30 min后上機(jī)檢測(cè)，所有抗體購(gòu)于美國(guó)Beckman coulter公司，采用流式細(xì)胞儀EPICS XL檢測(cè)，檢測(cè)方法按照說(shuō)明書執(zhí)行。

1.7療效評(píng)價(jià) 療效按RECIST1.1實(shí)體瘤評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分為：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)，疾病進(jìn)展(PD)，CR+PR為有效，CR+PR+SD為控制。無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)指自治療首日至病變進(jìn)展日；總生存期(OS)為自治療首日至死亡日或失訪日，均以月計(jì)算。隨訪截止時(shí)間：2015年6月。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)和生存分析Kaplan-Meier法，Log rank法檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CTC水平與T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的關(guān)系 本試驗(yàn)CTC水平在92～382，以其中位數(shù)198為分界點(diǎn)分為CTC高表達(dá)組和CTC低表達(dá)組。高表達(dá)組CD3+、CD4+顯著低于低表達(dá)組、CD8+顯著高于低表達(dá)組，CD4+/CD8+倒置，細(xì)胞免疫功能顯著低于CTC低表達(dá)組(P<0.001)；NK細(xì)胞顯著高于低表達(dá)組(P<0.001)。見表1。

表1 CTC表達(dá)水平與T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的關(guān)系

2.2TKI治療前后CTC表達(dá)水平與T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞變化的關(guān)系 CTC高表達(dá)組治療前后T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CTC低表達(dá)組CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+顯著升高，CD8+、NK水平顯著下降(P<0.05)，見表2。

表2 CTC高、低表達(dá)組治療前后T細(xì)胞亞群的變化

與治療前比較：1)P<0.05

2.3CD4+/CD8+與OS、PFS的關(guān)系 本組病例中位OS為15個(gè)月，1年生存率為60.6%，2年生存率為33.3%，3年生存率為12.1%。CD4+/CD8+比值<1為低表達(dá)組，≥1為高表達(dá)組。兩組OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.012,P=0.025)，見表3、圖1。本組病例PFS為6個(gè)月。CD4+/CD8+低表達(dá)和高表達(dá)組中位PFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.863,P=0.013)，見表4、圖1。

2.4NK細(xì)胞與OS、PFS的關(guān)系 NK細(xì)胞≥15.7%為高表達(dá)組，<15.7%為低表達(dá)組。NK細(xì)胞高表達(dá)和低表達(dá)組中位OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.958,P=0.000)，見表5、圖2。NK細(xì)胞高表達(dá)和低表達(dá)組中位PFS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.401,P=0.000)，見表6、圖2。

表3 CD4+/CD8+不同表達(dá)組OS比較

與高表達(dá)組比較：1)P<0.05;表4同

表4 CD4+/CD8+不同表達(dá)組PFS比較

圖1 CD4+/CD8+表達(dá)水平與晚期NSCLC患者OS、PFS關(guān)系

圖2 NK表達(dá)水平與晚期NSCLC患者OS、PFS的關(guān)系

表5 NK不同表達(dá)組OS比較

與高表達(dá)組比較：1)P=0.000；表6同

表6 NK不同表達(dá)組PFS比較

3 討 論

CTC是一種從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶中脫落的腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞可能經(jīng)周圍的血管進(jìn)入血液循環(huán)〔8〕，大部分因宿主的免疫系統(tǒng)、血流剪切力或自身凋亡而死亡。CTC存在于晚期肺癌患者外周血中，患者的細(xì)胞免疫功能受到嚴(yán)重抑制，無(wú)法及時(shí)清除循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞，少數(shù)有高度活力、高度轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞存活下來(lái)〔9〕，穿過(guò)血管及淋巴管，與血管內(nèi)皮黏附，定植于次級(jí)或遠(yuǎn)處器官，實(shí)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移〔10〕。

肺癌患者外周血 T 細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞活性的變化，是反映患者機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)和判斷療效的重要指標(biāo)〔11〕。CD3+T 細(xì)胞通常代表機(jī)體總T 細(xì)胞數(shù)量，CD4+T細(xì)胞代表T 輔助細(xì)胞，是人體抗腫瘤免疫的重要組成部分，可以通過(guò)干擾素(INF)-γ介導(dǎo)的機(jī)制直接殺傷腫瘤細(xì)胞〔12，13〕，對(duì)細(xì)胞免疫起正調(diào)節(jié)作用。CD8+T 細(xì)胞則代表T 抑制細(xì)胞，抑制機(jī)體免疫應(yīng)答，也對(duì)靶細(xì)胞有一定殺傷作用，起負(fù)調(diào)節(jié)作用。CD4+/CD8+比值可以反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，比值降低表明機(jī)體細(xì)胞免疫功能降低，抗腫瘤能力減弱。研究顯示，經(jīng)過(guò)TKI治療后NSCLC患者細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)得到明顯改善，靶向治療改善了NSCLC患者細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能〔7〕。老年晚期NSCLC患者體質(zhì)差，病情復(fù)雜，多伴有并發(fā)癥，免疫功能低，特別是細(xì)胞免疫功能常處于低水平。

NK細(xì)胞是細(xì)胞免疫中非特異性成分，不依賴抗體和補(bǔ)體，不需預(yù)先活化即可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，并能分泌細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)，而且NK 細(xì)胞還具有適應(yīng)性免疫的特性〔14〕。NK 細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞主要是通過(guò)穿孔素和顆粒酶B引起靶細(xì)胞的裂解，同時(shí)也可被腫瘤壞死因子(TNF) 激活殺傷靶細(xì)胞〔15〕，是一類在早期抗腫瘤免疫機(jī)制中起重要作用的效應(yīng)細(xì)胞。

綜上，老年NSCLC患者CTC表達(dá)水平與細(xì)胞免疫功能呈負(fù)相關(guān)，TKI治療使CTC低表達(dá)者免疫功能得到改善，且主要體現(xiàn)在細(xì)胞免疫功能上，CD4+/ CD8+低表達(dá)、NK細(xì)胞高表達(dá)患者能有更長(zhǎng)的OS及PFS。由于TKI可改善晚期NSCLC患者的細(xì)胞免疫功能，且有效可能亦與免疫功能增強(qiáng)有關(guān)，對(duì)此需要進(jìn)一步研究TKI改善NSCLC患者細(xì)胞免疫功能的機(jī)制。分子靶向藥物為老年晚期NSCLC的治療帶來(lái)了希望，還需要明確治療的優(yōu)勢(shì)人群、發(fā)掘更多的治療靶點(diǎn)及相關(guān)的預(yù)后和預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

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