不同灌溉和栽培方式對紅壤性水稻土微生物群落結構及多樣性的影響

張文鋒,時 紅,才 碩,武 琳,胡秋萍,徐 濤,張 昆*

(1.江西省紅壤研究所,江西 南昌 331717;2.江西省灌溉試驗中心站,江西 南昌 330201)

水稻是我國重要的糧食作物,南方紅壤稻田是我國水稻主產區(qū)之一,在全國水稻生產中占有重要地位。水稻產量受稻田水分管理、氣候、栽培等諸多因素影響,其中合理灌溉和栽培是確保水稻高產穩(wěn)產的行之有效的措施之一[1]。水稻具有廣泛水適應性,是農業(yè)用水的第一大戶,占中國農業(yè)用水總量的70%左右,每年在中國各稻區(qū)因干旱缺水造成的水稻減產均有發(fā)生[2]。在水資源短缺背景下,從傳統(tǒng)淹水灌溉發(fā)展到短期或長期無水層等節(jié)水灌溉方式可以在不影響作物產量的前提下,實現(xiàn)水的高效利用[3]。因此,發(fā)展節(jié)水農業(yè),提高水稻的水分利用效率,緩解水資源的供需矛盾,成為保障中國糧食安全的重大課題。另外,目前我國水稻種植方式包括人工栽插、機械插秧、機械直播、缽苗行栽等主要方式,隨著農村大量優(yōu)質勞動力轉移,稻農對輕簡栽培方式的需求愈發(fā)迫切,近年來,水稻生產機械化呈現(xiàn)出快速發(fā)展趨勢,種植機械化水平已達到 7.1%[4-5]。

土壤微生物是土壤的重要組成部分,是影響土壤肥力的重要因素,是衡量土壤質量、維持土壤肥力和作物生產的一個重要指標,對其所生存的微環(huán)境十分敏感,能對土壤環(huán)境脅迫迅速做出反應,進而導致群落結構發(fā)生改變[6]。土壤水分狀況不僅會直接影響微生物細胞的滲透狀態(tài),還會通過改變土壤理化性質以及土壤中養(yǎng)分的可利用性等間接對微生物產生影響。有研究表明,在土壤持續(xù)濕潤條件下的土壤微生物豐度與活性高于干旱條件下的,良好的水分條件有利于微生物群落的發(fā)展[7];土壤水分含量會嚴重影響微生物的數(shù)量與多樣性,在水分充足情況下,微生物活性與豐度高于缺水處理下的,同時細菌豐度在通氣性好的土壤中較高[8]。目前關于土壤微生物群落結構的研究較多地集中在土地利用方式、施肥方式和耕作方式等措施方面,而有關不同灌溉和栽培方式對稻田微生物群落結構和多樣性影響的研究報道甚少。本研究基于不同灌溉和栽培方式的田間實驗,運用高通量測序技術分析了淹水灌溉和節(jié)水灌溉以及不同栽培方式下稻田土壤微生物的群落結構和多樣性,以期為切實優(yōu)化稻田灌溉,提高微生物活性與水分利用率提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

本試驗研究于2016年在江西省灌溉試驗中心站試驗場進行。試驗場位于鄱陽湖流域贛撫平原灌區(qū)二干渠中游右岸,坐落在江西省南昌市南昌縣向塘鎮(zhèn)高田村,東經(jīng)116°00′,北緯28°26′,為平原地區(qū),屬亞熱帶季風氣候,多年平均氣溫為17.7 ℃,年降雨量為1685.20 mm,蒸發(fā)量(E601型)943 mm,日照時數(shù)1575.50 h。試驗區(qū)土壤為紅壤性水稻土,土質粘重。土壤呈酸性反應,基礎土壤(0～20 cm)的pH值為4.5～6.5,全氮(N)含量為1.03 g/kg,有機質含量為17.30 g/kg,全磷(P2O5)含量為0.41 g/kg,有效磷(P2O5)含量為6.14 mg/kg,速效鉀(K2O)含量為12.40 mg/kg。

1.2 試驗設計

以水稻節(jié)水灌溉為研究基礎,本試驗設定淹水灌溉和節(jié)水灌溉兩種灌溉模式,每種灌溉模式下設定移栽、拋秧、直播、機插秧四種栽培方式,共計8個小區(qū),每個小區(qū)面積120 m2(7.5 m×16.0 m)。供試早稻品種為中嘉早17,屬于秈型常規(guī)水稻,全生育期平均為109 d;供試晚稻品種為H優(yōu)518,屬于三系雜交中熟晚秈,全生育期108 d。

施肥水平設計為:直播稻施肥掌控“前促、中控、后補”的原則,采用“一基三追”的方法,氮肥用量為180 kg/hm2,基肥∶斷奶肥∶分蘗肥∶穗肥=4∶2∶2∶2,在1葉1心期施斷奶肥,在4葉1心期施分蘗肥,在移栽后35～40 d時施用穗肥;磷肥全部作基肥,施肥水平為90 kg/hm2;鉀肥用氯化鉀,施肥水平為180 kg/hm2,基肥∶斷奶肥∶分蘗肥∶穗肥=4∶2∶2∶2,其施肥時期與氮肥相同。其余3種稻作模式均采取基肥、分蘗肥和穗肥的施肥方式,其中氮肥、鉀肥的施肥比例均為基肥∶分蘗肥∶穗肥=4∶3∶3;磷肥全部做基肥,施肥水平和直播稻保持一致。各試驗處理小區(qū)(120 m2)的具體施肥量如表1。

表1 試驗各處理小區(qū)的具體施肥量

1.3 土樣采集

2016年分別在早稻灌漿期(6月25日)和成熟期(7月14日)采集土樣,采樣時灌漿期土壤處于淹水階段,成熟期土壤均處于排水落干階段。晚稻在水稻分蘗盛期(8月17日)采集土樣,分淹水處理和節(jié)水處理。每個小區(qū)采用5點法在根部周圍用土鉆采耕層土(直徑5 cm,深15 cm)。將土樣掰碎，剔除大中型土壤動物及根茬等,混合均勻后經(jīng)冷凍干燥，于-70 ℃保存,用于微生物群落結構(高通量測序)的分析。實驗設計及土壤樣品信息如表2。

1.4 測定方法

本研究采用16S rRNA的V3～V4區(qū)域作為目標DNA序列進行PCR擴增。以通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和506R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rDNA的V3～V4進行擴增。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,25個循環(huán);72 ℃延伸20 min。擴增結束后,對PCR擴增產物使用2%瓊脂糖進行凝膠電泳,檢查擴增效果。將樣品的PCR產物在Illumina-MiSeq平臺上進行高通量測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

首先使用軟件QIIME[9]對有效序列進行去雜和修剪，得到優(yōu)化數(shù)據(jù)。再通過歸類操作,將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組,1個小組就是1個OTU(operational taxonomic units)?？筛鶕?jù)不同的相似度水平,對所有序列進行OTU劃分,通常對97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平下的OTU代表序列進行分類學分析,并在各個分類水平下統(tǒng)計各土壤樣本的微生物群落組成。基于OTU計算微生物群落的豐度和多樣性指數(shù)。

表2 采集的土壤樣品信息

利用QIIME軟件根據(jù)公式(1)計算各土壤樣品的Chao1指數(shù)[10]。根據(jù)公式(2)和公式(3)分別計算每個樣品的香農(Shannon)指數(shù)和辛普森(Simpson)指數(shù)。

(1)

(2)

(3)

上式中：SChao1是Chao1指數(shù),代表群落豐富度指數(shù)；HShannon代表香農多樣性指數(shù)；DSimpson代表辛普森多樣性指數(shù)；Sobs是得到的OTU的數(shù)量；n1是只有1條序列的OTU數(shù)目；n2是只有2條序列的OTU數(shù)目；ni為第i個分類單元中包含的序列數(shù)；N為所有序列之和[11]。

2 結果與分析

2.1 Alpha多樣性分析

從表3中可知：所有樣品的覆蓋度指數(shù)均在90%以上；在97%分類水平下,不同水分管理和栽培方式下Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、OTU數(shù)量有所差異；除JXZK3、JXZK13外,其它樣品的覆蓋率較高,均在0.97以上,表明樣品中序列大多數(shù)被測出,序列未被測出的概率較低。

在早稻灌漿期,在淹水灌溉條件下,拋秧方式的土壤微生物群落豐富度指數(shù)(Ace、Chao1)和Richness最高,樣本中物種種類相對較多。在早稻成熟期,在節(jié)水灌溉條件下,機插方式的土壤微生物群落豐富度指數(shù)(Ace、Chao1)和Richness最高,樣本物種種類相對較多。在晚稻分蘗盛期,與淹水灌溉相比,節(jié)水灌溉在4種栽插方式下土壤微生物群落豐富度指數(shù)(Ace、Chao1)和Richness均更高,表明節(jié)水灌溉下土壤微生物種類相對較豐富。多樣性指數(shù)Simpson值越大,說明群落多樣性越高。在早稻灌漿期,在淹水灌溉條件下,拋秧方式的Shannon指數(shù)最高,表明此方式下的土壤微生物群落多樣性高于其他栽插方式下的。在早稻成熟期，在節(jié)水灌溉條件下,直播和機插方式的Shannon指數(shù)較高。在直播和機插方式下,早稻成熟期節(jié)水處理的土壤微生物多樣性指數(shù)(Shannon)高于早稻灌漿期淹水處理的。在晚稻分蘗盛期,在直播和拋秧方式下,節(jié)水灌溉的Shannon指數(shù)高于淹水灌溉的；在移栽和機插方式下,節(jié)水和淹水灌溉的Shannon指數(shù)均相等;在淹水灌溉條件下,Shannon指數(shù)的大小順序為直播>移栽>拋秧>機插;在節(jié)水灌溉條件下,Shannon指數(shù)的大小順序為直播>拋秧>移栽>機插。

2.2 微生物的群落結構

對16個土壤樣品進行高通量測序后，共獲得33個門和未分類細菌,圖1列出了微生物群落在門分類水平上的分布情況,33個門為Proteobacteria、Acidobacteria、Verrucomicrobia、Chloroflexi、Bacteroidetes、Actinobacteria、Cyanobacteria/Chloroplast、Ignavibacteriae、Firmicutes、Planctomycetes、Chlamydiae、Spirochaetes、Nitrospirae、Gemmatimonadetes、Elusimicrobia、Candidatus_Saccharibacteria、Parcubacteria、Aminicenantes、Omnitrophica、Armatimonadetes、Latescibacteria、Lentisphaerae、candidate_division_WPS-2、candidate_division_WPS-1、Microgenomates、Cloacimonetes、BRC1、Fibrobacteres、SR1、Fusobacteria、Hydrogenedentes、candidate_division_ZB3、Deinococcus-Thermus。16個樣品中微生物群落組成類似,但不同樣品各種微生物所占的比例有所差異,其中Proteobacteria(變形菌門)占主要優(yōu)勢,在所有樣品中所占的比例均在30%～40%。其它較占優(yōu)勢的菌門為：Acidobacteria(酸桿菌門),所占比例在10.00%～16.10%;Chloroflexi(綠彎菌門),所占比例在5.40%～14.90%。還有一些占有較低比例的菌門,例如：Verrucomicrobia(疣微菌門,占3.50%～8.30%)、Bacteroidetes(擬桿菌門,占2.90%～7.90%)、Actinobacteria(放線菌門,占0.90%～3.50%)。變形菌門所占比例在早稻成熟期高于早稻灌漿期,厚壁菌門所占比例在早稻灌漿期高于早稻成熟期。

表3 不同水分管理和栽插方式下稻田土壤微生物的多樣性

圖1 不同土壤樣品中微生物門水平菌群分布

微生物群落在屬分類水平上的分布情況如圖2所示,其中占優(yōu)勢的菌屬分別為Unclassified_Bacteria(11.00%～17.80%)、Unclassified_Deltaproteobacteria(4.70%～6.30%)、Subdivision3_genera_incertae_sedis(1.50%～6.10%)、Unclassified_Chloroflexi(2.00%～6.90%)、Unclassified_Betaproteobacteria(1.90%～5.50%)、Unclassified_Anaerolineaceae(1.60%～5.40%)、Unclassified_Bacteroidetes(1.50%～4.70%)、Gp1(1.70%～3.60%)、Geobacter(1.00%～3.40%)、Gp18(1.20%～3.00%)、Gp3(1.10%～2.60%)。

2.3 Beta多樣性分析

圖3中每個點表示1個樣品,點與點之間的距離越大,表示兩個樣品的物種組成差異越大,反之則表示物種組成越相似。由圖3可知,JXZK7、JXZK8、JXZK9、JXZK10的物種組成與JXZK1、JXZK2、JXZK3、JXZK4差異較大。在早稻灌漿期處于淹水下,采用拋秧方式的土壤微生物組成與采用直播、移栽、機插種植方式的差異均較大;在早稻成熟期處于淹水下,直播、移栽、拋秧、機插方式之間土壤微生物組成差異均較小。在晚稻分蘗盛期,處于淹水處理下,直播、移栽、拋秧、機插之間土壤微生物組成差異均較小;而處于節(jié)水處理下,直播與移栽、拋秧、機插之間土壤微生物組成差異均較大。

圖2 不同土壤樣品中微生物屬水平菌群分布

圖3 不同土壤樣品微生物群落主成分分析

3 討論

土壤微生物是土壤重要的活體成分,土壤微生物量是土壤肥力水平高低的重要生物學指標,可反映出N、P等土壤養(yǎng)分轉化能力的強弱,在養(yǎng)分運轉、有機質形成和分解、土壤結構維持、溫室氣體產生等方面發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[12-14]。但土壤微生物數(shù)量、活性與種群結構又受到土壤質地、種植方式、土壤水肥管理措施等多種因素的影響[15]。相關研究表明,土壤微生物的多樣性和豐度受土壤結構、水熱狀況及通氣性的直接影響[16]。

本研究結果顯示,在晚稻分蘗盛期,與淹水灌溉相比,節(jié)水灌溉土壤微生物群落的豐富度指數(shù)(Ace、Chaol)和Richness均更高,土壤微生物種類相對較豐富,這可能是由于節(jié)水灌溉改變了土壤的理化性質,創(chuàng)造了土壤的好氧環(huán)境,而通氣透水性能好的土壤有利于改善微生物的繁育條件,增加土壤微生物數(shù)量,從而有利于土壤微生物群落的發(fā)展[3,17]。

另外,本研究結果表明,在早稻和晚稻的土壤中變形菌門(Proteobacteria)占主要優(yōu)勢,所占的比例均在30%～40%；其次為綠彎菌門、酸桿菌門。這與前人的研究結果基本一致,例如：沈冰潔等[14]研究發(fā)現(xiàn),稻田土壤優(yōu)勢細菌類群為變形菌,其次為綠彎菌,兩者相對豐度高達60%以上；Jangid等[18]分析了不同類型耕作土壤的細菌種群結構,發(fā)現(xiàn)變形細菌占統(tǒng)治地位,其所占比例為30.60%～43.20%；Ge等[19]研究了長期施肥的農耕土壤的細菌多樣性,也發(fā)現(xiàn)包括α-、β-、γ-變形細菌占細菌類群的30.50%,為優(yōu)勢群落。

4 結論

在直播和機插方式下,早稻成熟期節(jié)水處理土壤微生物多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))高于早稻灌漿期淹水處理的。在晚稻分蘗盛期,直播、移栽、拋秧、機插四種栽培方式下節(jié)水灌溉處理土壤微生物群落的豐富度指數(shù)均高于淹水灌溉處理的。在雙季稻田試驗,早稻和晚稻土壤變形菌門占主要優(yōu)勢,所占的比例均在30.00%～40.00%；其次為綠彎菌門和酸桿菌門,所占比例分別為5.40%～14.90%、10.00%～16.10%。

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