硫離子熒光探針的研究進展

董天宇，朱 昱，李宏達，劉思佳

(中國刑事警察學院 法化系，遼寧 沈陽 110035)

硫化物(硫化鈉，硫化鋇，硫化氫等)大量的存在于自然界中，在工業(yè)生產、醫(yī)藥合成和軍工等方面具有廣泛的應用。硫化物同時也是一種有毒的物質，如果大量的硫化物進入水體或空氣中對自然環(huán)境與人類健康能夠產生極大的風險。人們過量的吸食硫化物會引發(fā)糖尿病、高血壓、肝硬化、唐氏綜合征等疾病[1]。在我國，硫化物的含量是飲用水及地表水檢測的常用指標之一。規(guī)定指出，污水中的硫化物濃度不得超過1mg/L，飲用水中硫化物濃度不得超過0.02mg/L。目前，檢驗硫離子的方法有很多種，只是各有所長，各有不足。主要的檢測方法有：碘量法、亞甲藍法、試紙法、離子色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、離子選擇電極法、紫外分光光度法等。在這些方法中有的靈敏度低、樣品需求量大，有的前處理比較復雜、耗時比較長[2]。因此開發(fā)一種操作簡單、響應速度快、靈敏度高、選擇性好的硫離子檢驗方法具有重要的實際意義。

1 熒光探針的設計原理與分類

熒光探針是在分子識別基礎上發(fā)展起來的一種新型檢測方法。由于其具有操作簡單、響應速度快、靈敏度和選擇性好等優(yōu)點，在生物學、醫(yī)學、藥學、環(huán)境科學等領域具有非常廣泛的應用。熒光探針是由識別基團(Receptor)、連接臂(Spacer)和熒光團(Fluorophophre)三個部分組成[3]。識別基團與被測物之間通過非共價相互作用(如靜電引力、氫鍵、配位鍵合、范德華力、分子間作用力等)以及化學反應等方式誘導熒光團的光學性能(熒光強度、熒光壽命、熒光波長等)發(fā)生改變，將熒光探針與被測物之間的相互作用轉化為儀器可探測的或人為感知的信號[4]，實現快速地、準確地分析被測物的目的。

熒光探針的設計原理主要有以下幾種：光誘導電子轉移機理(Photo-induced Electron Transfer, PET),分子內電荷轉移機理(Intra-molecular Charge Transfer, ICT),配合體-金屬電荷轉移機理(Ligand-Metal Charge Transfer, LMCT)，激發(fā)態(tài)分子內質子轉移機理(Excited-state Intra-molecular Proton Transfer, ESIPT),熒光共振能量轉移機理(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)等[5]。按照熒光探針的設計原理可以分為三類：(1)鍵合型熒光探針，即基于配位作用的熒光探針；(2)取代型熒光探針，如識別目標的取代；(3)反應型熒光探針，也就是說探針主體與識別物之間發(fā)生了特定的、不可逆的化學反應[6]。

依據硫離子的兩種特性，即容易與堿金屬和堿土金屬形成難溶的物質和強的親核性，可以將硫離子的熒光探針分為兩類，置換型硫離子熒光探針和反應型硫離子熒光探針。下面按照作用機理的不同進行詳細闡述。

2 置換型硫離子熒光探針

首先，熒光探針與堿金屬或堿土金屬發(fā)生絡合反應形成新的配合物，當加入硫離子后，硫離子與堿金屬或者堿土金屬發(fā)生無機反應，生成難溶的硫化物，此時，熒光探針被置換出來，釋放出熒光信號，實現了熒光探針ON-OFF-ON的變化，從而制備出可逆性熒光探針。

2013年尹炳柱教授課題組[7]成功合成了基于香豆素-DPA-Cu2+復合體的硫離子置換型熒光探針1-Cu2+。在水溶液中探針識別S2-具有很好的選擇性、靈敏度和抗干擾能力，而且僅需2 當量硫離子就能完全置換出香豆素衍生物，使熒光信號完全恢復。另外，作者獲得了探針的單晶結構，通過single-crystal X-ray衍射分析獲得了絡合模式。

2012年鄭教授[8]課題組發(fā)表了一種以熒光素作為熒光發(fā)光基團的置換型熒光探針2-Cu2+，通過設計多個雜原子配位點使其與銅離子有很好的絡合能力。該絡合物對硫離子形成了一種off-on型的熒光開關，而且還顯示了很好的可逆性。

2018年李教授[9]課題組開發(fā)了一種基于雙羥基喹啉并半菁染料-Cu2+置換型熒光探針3-Cu2+。探針識別硫離子具有非常好的選擇性，不受其他類似分析物(其中包括生物硫醇，氰化鈉，活性物質等)的干擾。在交替滴加銅離子和硫離子時，探針展現出良好的可逆性，呈現出紅色熒光信號的開與關。最后，探針成功的應用于真實的血液樣本和生物體內檢測硫化物。

圖3 置換型熒光探針3

3 反應型硫離子熒光探針

反應型熒光探針與被測物的結合一般是通過不可逆的化學反應，被測物與熒光探針作用后，新的加成物能夠使測試體系的熒光信號發(fā)生變化(熒光強度、發(fā)射波長等)。此外，被測物還可以作為熒光探針自身反應的催化劑，生成新的化合物，通過檢測新化合物的生成間接的識別被測物。

2012年，Cho課題組[10]報道了第一個硫化氫雙光子熒光增強型探針4。探針在pH值=7.2的HEPES緩沖溶液中，當加入20當量硫化鈉反應后，單光子光譜顯示在548nm出現一個強的發(fā)射峰，其檢測下限達到5～10 μm,其雙光子熒光光譜也得到相似的結果，熒光增加倍數達到了21倍。探針4不僅對常見活性氮(RNS)和活性氧(ROS)表現出好的選擇性，而且對活性硫化物(RSS)(如：半胱氨酸和谷胱甘肽)也表現出好的選擇性。在750nm激發(fā)時，pH值=7.2的HEPES緩沖溶液中，探針4與硫化氫反應產物4-NH2的雙光子活性截面積分別為15GM和302GM，這說明探針4具有很好的雙光子吸收效果。探針4不僅可以應用于細胞里硫化氫成像分析，還可以應用在組織里硫化氫成像分析，其在組織里對硫化氫檢測深度達到190μm。

圖4 反應型熒光探針4

Ahn課題組[11]設計了一個新的增強型雙光子硫化氫探針5。它是利用硫化氫先與熒光探針5中的醛基反應，再通過Michael加成到相鄰的不飽和丙烯酸醋上，形成一個Thioacetal半縮醛結構。采用這種新的策略，探針對硫化氫具有的選擇性好、靈敏度高、響應速度快等優(yōu)點。更重要的是，雙光子探針實現了在活細胞中識別硫化氫，呈現雙光子成像的目的。

圖5 反應型熒光探針5

Liu課題組[12]開發(fā)了一種打開型熒光探針6。以熒光素作為熒光發(fā)光團，醛基作為反應基團，利用S2-的親核性，與醛基發(fā)生縮醛反應，可以定量檢測S2-，且檢測的S2-濃度范圍比較寬(2.5～1000μm)。由于探針里面有兩個親電子的羰基，硫化氫進行了兩次親核反應，因此探針表現出對S2-較好的選擇性。

Xian課題組[13]研發(fā)了一種反應型熒光探針7，首先H2S迅速進攻探針分子中的二硫鍵，然后由生成的硫醇中間體進一步進攻酯基，經自環(huán)化后，釋放出熒光素衍生物，該探針可以與H2S快速反應，實現“關-開”型熒光探針。

4 展望

近年來硫離子熒光探針在生命科學、環(huán)境 科學、材料科學、信息科學等領域得到了迅猛的發(fā)展，同時也獲得了許多優(yōu)異的熒光探針。通過比較分析可以發(fā)現，二者具有各自的特點。

首先，反應型硫離子熒光探針通常對硫離子具有很高的選擇性 。而且，反應型熒光探針發(fā)生化學反應后的熒光產物通常是不與金屬離子絡合的，從而有效避免了熒光發(fā)生猝滅。此外，反應型熒光探針體系中，由于與客體作用后生成了不同化學結構的光活性產物，會產生肉眼可見的顏色變化，從而為鑒定提供了方便。

其次，置換型硫離子熒光探針具有反應時間較短，反應速度快，反應可逆等優(yōu)點，但由于它是和金屬絡合產生的熒光探針，因此也具有選擇性差，易受其他金屬離子干擾等缺點。

總之，目前所開發(fā)的硫離子熒光探針還存在諸多問題，需要我們克服與解決，從而更好地應用熒光探針檢驗硫離子。