抗菌肽研究進(jìn)展及應(yīng)用

甄陽光

（四川省水產(chǎn)學(xué)校，四川 成都 610041）

抗菌肽（AMPs）是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽，其N端含極性氨基酸，富含Pro，而C端通常酰胺化[1-2]。1980年瑞典科學(xué)家在研究北美天蠶的免疫機制時，發(fā)現(xiàn)滯育蛹注射陰溝通桿菌及大腸桿菌后，其血淋巴中產(chǎn)生了具有抑菌作用的多肽類物質(zhì)，即天蠶素[3-5]。后來，相繼從細(xì)菌、真菌、兩棲類、昆蟲、高等植物、哺乳動物乃至人類中發(fā)現(xiàn)并分離獲得有抗菌活性的多肽[6]。迄今為止，在不同動物組織中已發(fā)現(xiàn)千余種有抗菌作用的蛋白質(zhì)和多肽，且有70余種的結(jié)構(gòu)已被測定[7]。此外，因越來越多的細(xì)菌對傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生耐藥性，使AMPs受到廣泛的關(guān)注。目前，對AMPs的來源、理化特性、作用機制、安全性等進(jìn)行了深入研究，并建立了AMPs網(wǎng)上更新數(shù)據(jù)庫。本文就AMPs的理化特性、作用機制和應(yīng)用等作以綜述。

1 抗菌肽的理化特性

AMPs一般由12～50個氨基酸組成，無（弱）免疫原性，水溶性較好，等電點為8.9～10.7，且其一級結(jié)構(gòu)具有較強的保守性，因富含疏水和堿性氨基酸而具有較強的陽離子特征，因此多數(shù)AMPs在正常生理條件下帶正電荷[8-11]。AMPs的自身濃度、外界溫度、鹽離子濃度及pH對其抑菌活性有重要影響[12]。當(dāng)在60～100℃時，AMPs抑菌效果依然明顯，在121℃時其抑菌效果才有下降趨勢。純化后的蠶蛹AMPs在100℃處理20 min后對大腸桿菌的抑菌圈直徑仍可達(dá)1.80 cm；pH在7.0～7.5時抑菌圈平均直徑為1.98 cm，室溫放置3 h后抑菌圈直徑可達(dá)2.05 cm；鹽離子濃度在0.2 mol·L-1時抑菌圈直徑為2.02 cm[13]。表明AMPs具有較強熱穩(wěn)定性，在較強離子強度和較低的pH下仍可保持較強的活性，并且部分AMPs還有抗胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解的作用。

2 抗菌肽的作用機制

目前，對于AMPs的確切作用機制尚未準(zhǔn)確定論，但研究者提出了多種假說，如形成膜通道、細(xì)胞內(nèi)殺菌、調(diào)控免疫發(fā)揮抑菌活性等。

2.1 細(xì)胞膜損傷機理

生理狀態(tài)下帶正電荷的AMPs以物理的方式吸附于細(xì)菌胞膜，破壞胞膜的完整性，導(dǎo)致胞質(zhì)外漏而殺滅細(xì)菌[14]。帶正電荷AMPs能與細(xì)菌胞膜上帶負(fù)電荷的LTA、TA、LPS及LPG以靜電作用而吸附于細(xì)胞膜上，然后AMPs的疏水端嵌入磷脂雙分子層中牽引其進(jìn)入磷脂雙分子層或改變膜表面張力或引起磷脂單分子層彎曲或形成肽-脂聚合物，從而擾亂雙分子層中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等組分原有的排列秩序，再結(jié)合AMPs分子間的相互運動，最終形成跨膜通道，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外漏引起死亡[15]。目前，跨膜通道以“桶板”“地毯”“環(huán)形孔”“ 聚集體”“筏沉沒”和“分子電穿孔”等模型備受關(guān)注，能較好地解釋AMPs的膜通道機制[16]。

2.2 細(xì)胞內(nèi)殺菌機制

研究表明，部分AMPs還有胞內(nèi)作用靶標(biāo)，即AMPs穿透胞膜進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)，擾亂其生理活性，從而殺滅細(xì)菌[17]。如源于蛙的buforinⅡ可直接穿過胞膜進(jìn)入胞質(zhì)中積聚與DNA和RNA作用，當(dāng)濃度在100 μg·mL-1時，其能完全抑制大腸桿菌DNA和RNA的合成，而在150～200 μg·mL-1時，其顯著抑制蛋白質(zhì)的合成，最終殺滅菌體[18]。同樣地，AMPs PR39、NK-18、HNP1/2也能進(jìn)入大腸桿菌菌體內(nèi)抑制其DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成[19]。另外，死亡素和人唾液抗菌蛋白富組蛋白能特異性地作用于線粒體，抑制細(xì)菌的呼吸作用達(dá)到殺菌目的[20]。此外，部分AMPs還可調(diào)節(jié)菌體基因表達(dá)，從而干擾細(xì)菌繁殖，如攻擊素、麻蠅素-Ⅱ能抑制大腸桿菌膜蛋白Omp（C、F、A）和LamB基因的表達(dá)及細(xì)胞壁成分的合成，導(dǎo)致菌體生長受阻[20]。

2.3 調(diào)控免疫發(fā)揮抑菌活性

部分AMPs雖不能直接殺死細(xì)菌，但其可通過增強機體免疫力而發(fā)揮其抑菌活性[21]。AMPs能降低LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制促炎性因子的合成，而在正常生理狀態(tài)下可誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的分泌，從而募集免疫細(xì)胞提高機體抗感染能力，達(dá)到抑菌的目的[22-23]。

陽離子AMPs的作用機制與細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)密切關(guān)系，因此AMPs發(fā)揮抑菌功能而不傷害宿主正常細(xì)胞主要是因細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的差異所致。真核細(xì)胞膜主要是由鞘磷脂、中性磷脂和膽固醇等不帶電荷的物質(zhì)組成，因此帶正電荷的AMPs不能與之結(jié)合。同時，真核細(xì)胞膜中含有細(xì)菌細(xì)胞膜中缺少的膽固醇，因此磷脂雙分子層更加穩(wěn)固，不易形成膜通道。真核細(xì)胞膜上磷脂的不對稱分布、細(xì)胞骨架的存在和體內(nèi)血清成分等均可削弱AMPs對真核細(xì)胞的毒性作用。此外，AMPs的氨基酸組成決定了其兩親性、電荷量以及疏水程度等性質(zhì)，也決定了其抑菌機制和對微生物細(xì)胞的選擇性[24]。

3 抗菌肽在畜牧業(yè)上的應(yīng)用

近年來，抗菌肽因具有與抗生素不同的殺菌機制和抗菌譜廣等特點，成為新型飼料添加劑，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)，其可抑制或殺滅宿主體內(nèi)病原菌，改善腸道菌群，提高免疫力，促進(jìn)動物生長。

3.1 抗菌肽的促生長作用

在畜禽飼糧中添加AMPs能抑制病源微生物增殖代謝，改善宿主腸道菌群，促進(jìn)畜禽生長發(fā)育，提高畜禽產(chǎn)品質(zhì)量。不同濃度的AMPs能顯著降低仔公雞或肉雞腸道中大腸桿菌的豐度，提高雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量，改善腸道菌群，降低料重比，促進(jìn)肉雞生長[27-28]。陳蕓等在山羊飼糧中添加復(fù)合AMPs能顯著降低變形菌門和螺旋菌門的含量，提高與生長相關(guān)的部分降解纖維菌屬和普雷沃菌屬的含量[29]。姜文等發(fā)現(xiàn)，AMPs能顯著提高斷奶仔豬的末重、平均日增和直腸乳酸桿菌和雙歧桿菌豐度，降低料重比、腹瀉率和大腸桿菌豐度，表明AMPs能顯著改善斷奶仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高其生長性能[30]。

3.2 抗菌肽的免疫作用

AMPs是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，被認(rèn)為是機體免疫的第一道防線，其能誘導(dǎo)單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、未成熟DC和T-淋巴等細(xì)胞的趨化性，調(diào)控B和T分泌細(xì)胞因子的模式，并產(chǎn)生多種趨化因子[31]。研究表明，AMPs可作為魚類潛在的防御性武器，用于防治新出現(xiàn)的破壞性疾病，其能快速擴散到感染部位，招募免疫細(xì)胞到感染組織中和病原體[32]。白建等用不同濃度的AMPs飼喂1日齡的AA肉雞，發(fā)現(xiàn)不同濃度的抗菌肽顯著提高21日齡肉雞的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)和42日齡肉雞的法氏囊指數(shù)，認(rèn)為AMPs能提高肉雞免疫器官指數(shù)[28]。劉莉如等用天蠶素AMPs飼喂海蘭褐蛋用仔公雞42 d，結(jié)果表明，血清中IgG、IgA，補體C3、溶菌酶含量顯著提高，認(rèn)為AMPs可提高蛋用仔公雞的免疫力[27]。楊顏銥等發(fā)現(xiàn)復(fù)合AMPs能顯著提高川中黑山羊血清中IgA、IgG、IgM，IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、IFN-γ以及補體C3、C4的濃度，表明復(fù)合AMPs能增強山羊的免疫力[33]。也有研究表明，AMPs能結(jié)合LPS從而展現(xiàn)出抗炎活性，并在衰老過程中，AMPs與血清中IL-10、IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子濃度呈現(xiàn)逆相關(guān)性，表明AMPs可以作為免疫調(diào)節(jié)劑[31,34]。

4 小結(jié)

在原核生物、大多數(shù)真核生物及所有動物體內(nèi)均存在具有防御作用的AMPs。因此，AMPs作為畜禽養(yǎng)殖等領(lǐng)域的飼料添加劑、治療劑或免疫調(diào)節(jié)劑等有巨大的潛力。大量研究已表明這些小生物活性肽的益生活性，但其具體機制尚不十分明確，并有研究報道部分細(xì)菌通過減弱AMPs結(jié)合、降低AMPs有效濃度、修飾細(xì)胞膜、形成生物膜及信號調(diào)節(jié)等方式產(chǎn)生對AMPs的耐受性。此外，AMPs在人類臨床上的應(yīng)用仍然有限。因此，AMPs作為新一代抗微生物藥物具有廣闊的前景，但對于其作用機制、耐藥性、安全性和穩(wěn)定性等方面仍需要進(jìn)一步的研究，只有綜合考慮AMPs的作用機制和細(xì)菌對其的抗性機制，避免在生產(chǎn)中濫用，才能揚長避短，造福人類。