長(zhǎng)鏈非編碼RNA 在食管癌中的研究進(jìn)展

李國(guó)良 朱明闖 熊鵬 朱珉

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院胸外科（武漢430030）

在世界范圍內(nèi)食管癌是第八大常見(jiàn)癌癥，也是主要致命的惡性腫瘤，整體5年生存率從15%～20%不等［1］。食管癌（EC）有兩種組織學(xué)形式：食管腺癌（EAC）和食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）。ESCC 通常是由于正常食管鱗狀上皮細(xì)胞不典型增生逐漸演變而來(lái)，而EAC 是由于腸上皮細(xì)胞化生或是由食管下段復(fù)層上皮經(jīng)Barrett 食管（BE）慢慢演變而來(lái)，近年來(lái)，EAC 的發(fā)病率有升高趨勢(shì)。我國(guó)中北部是食管癌的高發(fā)地區(qū)，主要是以ESCC 為主，據(jù)有關(guān)研究報(bào)道所有與食管癌有關(guān)的死亡中有一半以上發(fā)生在中國(guó)［2-3］?；谖覈?guó)的現(xiàn)狀，亟需尋找食管癌新的診斷方法和治療手段。

目前隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)的深入研究、高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)98%的基因被轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA（ncRNA），而在生物進(jìn)化過(guò)程中這些基因都被保留了下來(lái)，這使傳統(tǒng)的基因表達(dá)調(diào)控模式受到嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。此外，目前已知的ncRNA 有76%被轉(zhuǎn)錄成lncRNAs，并且具有組織特異性［4-5］。已有研究證明lncRNAs 在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮核心作用，同時(shí)參與基因轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)的翻譯后修飾等［6］。目前，有大量與食管癌相關(guān)的lncRNAs 被鑒定出來(lái)，廣泛存在于血清、血漿、尿液和腦脊液等體液中，與食管癌的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系［7］。本文重點(diǎn)總結(jié)與食管癌相關(guān)的lncRNA 的功能和分子調(diào)節(jié)機(jī)制，并討論他們?cè)谑彻馨┰\斷和治療上的應(yīng)用。

1 LncRNA 的結(jié)構(gòu)及分類

根據(jù)鏈的長(zhǎng)短不同，ncRNA 可以分為長(zhǎng)度在50 nt 之內(nèi)的短鏈ncRNA，50～200 nt 的中鏈ncRNA 和大于200 nt 的lncRNA。與另外兩種ncRNA 相比較，lncRNA 具有數(shù)量多，類型多以及作用模式多的特點(diǎn)［8］。根據(jù)功能，lncRNA 可分為信號(hào)型、誘餌型、指導(dǎo)型和支架型。根據(jù)基因組中的位置可分為基因內(nèi)（intronic）lncRNA、基因間（intergenic）lncRNA、正義（sense-overlapping）lncRNA、反義（antisense）lncRNA、雙向（bidirectional）lncRNA 五類。 基因內(nèi)lncRNA起源于內(nèi)含子區(qū)域，在前體mRNA 剪接時(shí)產(chǎn)生，其序列不與外顯子重疊；基因間lncRNA 是起源于兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因之間，但與最近的蛋白質(zhì)編碼基因間隔大于10 kb；正義lncRNA 與蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄同向，序列可以重疊多個(gè)內(nèi)含子與外顯子；反義lncRNA 是反義轉(zhuǎn)錄物，其轉(zhuǎn)錄方向與蛋白質(zhì)編碼基因相反，序列至少重疊一個(gè)外顯子；雙向lncRNA 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)距離蛋白質(zhì)編碼基因啟動(dòng)子位置小于1 000 bp，轉(zhuǎn)錄方向相反［9］。

2 LncRNA 在ESCC 中調(diào)控機(jī)制

2.1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用 真核生物的轉(zhuǎn)錄具有空間和時(shí)間的特異性，機(jī)制非常復(fù)雜。轉(zhuǎn)錄起始時(shí)通常需要各種蛋白因子如轉(zhuǎn)錄因子（TF）與RNA 聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物（TIC），因此TF 活性變化可以影響靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。β-catenin 最初被發(fā)現(xiàn)是一種粘附因子，但是研究人員現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)β-catenin 是一種多功能蛋白，在Wnt∕β-catenin 信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵組分，并且可以作為TF 與ESCC 相關(guān)的lncRNA 發(fā)生相互作用［10］。據(jù)報(bào)道［11］lncRNA UCA1（尿路上皮癌相關(guān)1）是一種在ESCC 中表達(dá)水平下調(diào)的lncRNA，其失調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，遷移和侵襲。LncRNA UCA1 過(guò)表達(dá)可以使細(xì)胞核中β-catenin 活性降低，并因此抑制Wnt ∕β-catenin 信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而下調(diào)下游的癌基因c-Myc 的表達(dá)，這一結(jié)果顯示lncRNA UCA1 通過(guò)抑制β-catenin 的活性起到抑癌的作用，因此如果檢測(cè)出患者體內(nèi)lncRNA UCA1 表達(dá)量降低，說(shuō)明患ESCC 的可能性較高。

E2F1 是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，被激活后可使細(xì)胞由G1 期向S 期轉(zhuǎn)變。CHEN 等［12］發(fā)現(xiàn)lncRNA ANRIL 在ESCC組織中的表達(dá)水平較正常組織顯著升高，當(dāng)其被沉默后，E2F1 表達(dá)明顯降低，并上調(diào)p15INK4b和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)的表達(dá)因子β1 基因的表達(dá)。因此不難發(fā)現(xiàn)促癌基因lncRNA ANRIL 是通過(guò)TGFβ1∕Smad 經(jīng)典信號(hào)通路調(diào)控ESCC 細(xì)胞的增殖。

2.2 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用 真核生物基因的表達(dá)不僅可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄方式進(jìn)行調(diào)控，也可以通過(guò)加工修飾RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，而有些lncRNA 可以參與mRNA 的剪接和修飾或者充當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNAs（ceRNAs）調(diào)控各項(xiàng)生命活動(dòng)。WU 等［13］在全基因組水平上研究了位于ESCC 易感位點(diǎn)上的lncRNAs 對(duì)患病風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的影響，結(jié)果從326 例確診ESCC 患者的標(biāo)本中鑒定出lincRNA-uc002yug.2，并測(cè)得其在癌組織中普遍過(guò)表達(dá)，此外發(fā)現(xiàn)lincRNA-uc002yug.2 在細(xì)胞核中促進(jìn)RUNX1（Run-ralated transcription factor 1）和選擇性剪接因子的復(fù)合體形成，以產(chǎn)生更多的RUNX1a；同時(shí)減少CEBPα（CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白-α）基因表達(dá)，最終促進(jìn)ESCC 的進(jìn)展。

ceRNA 是一種新的基因表達(dá)調(diào)控模式，而非一種新的RNA 分子。在這個(gè)模式中，編碼RNAs 和ncRNAs（lncRNA，cirRNA 和假基因）之間相互作用從而更有效實(shí)現(xiàn)編碼RNA 和ncRNA 之間的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［14］。LI 等［15］發(fā)現(xiàn)miR-301a 可以作為分子海綿直接與lncRNA GAS5 作用，調(diào)控趨化因子CXCR4 的表達(dá)，參與ESCC 細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。lncRNA MALAT1 可受miR-101和miR-217 兩種基因的影響而表達(dá)下降，進(jìn)而下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因（如p21，p27 和B-MYB）和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（如MIA2，ROBO1 和CCT4）的表達(dá)，最終起到抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲的作用［16］。

翻譯后修飾（PTM）是指mRNA 翻譯成的多肽鏈經(jīng)化學(xué)修飾（如甲基化、磷酸化、泛素化等）和酶促反應(yīng)后形成成熟蛋白質(zhì)的過(guò)程。HU 等［17］研究顯示lncRNA MALAT1高表達(dá)可促進(jìn)ATM-CHK2 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)信號(hào)通路中ATM，CHK2，CDC25C 和CDK1 等蛋白的去磷酸化，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖。YOON 等［18］報(bào)道lncRNA LUCAT1 通過(guò)上調(diào)UHRF1（泛素樣含PHD 和環(huán)指域蛋白）泛素化腫瘤抑制因子DNMT1（DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶1），導(dǎo)致ESCC 的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。Lü等［19］研究發(fā)現(xiàn)LncRNA MEG3 具有類似作用，可以下調(diào)MDM2（一種E3 泛素連接酶）減低其對(duì)P53 泛素化降解的作用，從而抑制ESCC 細(xì)胞的增殖和侵襲。

2.3 表觀遺傳學(xué)修飾作用 表觀遺傳是指在沒(méi)有細(xì)胞核DNA 改變的情況下，基因功能可逆和可遺傳的改變。這些修飾改變包括：染色質(zhì)重塑，DNA 的甲基化和組蛋白修飾［20］。

染色質(zhì)重塑復(fù)合物被lncRNAs 招募到特定基因組位點(diǎn)是基因表達(dá)調(diào)控和癌癥發(fā)病機(jī)制的常見(jiàn)現(xiàn)象。已有研究報(bào)道［21］，20%的lncRNAs 與具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性PRC2（polycomb repressive complex 2）相關(guān)，其中染色質(zhì)重組復(fù)合物EZH2（組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶）是PRC2 的功能性酶的重要組成成分。LncRNA POU3F3 位于其靶基因POU3F3 上游約4 kb 處，它可以募集EZH2，將DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶聚集到POU3F3 的啟動(dòng)子中，使啟動(dòng)子致密超甲基化。ESCC 中上調(diào)的lncRNA POU3F3 進(jìn)一步增加POU3F3的甲基化水平，降低其表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［22］。

WANG 等［23］發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1 也可以與EZH2 相互作用，在體外實(shí)驗(yàn)中，沉默lncRNA MALAT1 后上調(diào)EZH2 表達(dá)，從而抑制β-catenin 和Lin28 蛋白的合成，通過(guò)經(jīng)典的Wnt∕β-catenin 通路調(diào)控癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移。

DNA 甲基化是最早的表觀遺傳學(xué)修飾之一，它通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，DNA 構(gòu)象，DNA 的穩(wěn)定性以及DNA與蛋白質(zhì)的相互作用來(lái)控制基因的表達(dá)。一般情況下，DNA 的甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá)，修飾的部位主要發(fā)生在CpG 位點(diǎn)。LOC100130476 是含有3 個(gè)CpG 島的lncRNA［20］。GUO 等［24］發(fā) 現(xiàn)lncRNA LOC100130476 在ESCC 中 因 外 顯子1 中的CpG 位點(diǎn)高甲基化而低表達(dá)，該研究結(jié)果顯示這種lncRNA 作為ESCC 的腫瘤抑制基因與TNM 分期和癌癥細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)。H19 和IGF2（胰島素樣因子2）是連鎖交互印記的基因，ICR（imprinting control regions）位于H19 基因啟動(dòng)子上游12 kb 的區(qū)域，他可以調(diào)控H19 和IGF2 的表達(dá)，這三者構(gòu)成的通路對(duì)細(xì)胞的增殖有重要作用。GAO 等［25］發(fā)現(xiàn)lncRNA 91H 能夠促進(jìn)91H∕ICR 之間的甲基化，進(jìn)而抑制基因IGF2 的表達(dá)，調(diào)控ESCC 的進(jìn)展。lncRNA 91 表達(dá)下調(diào)的ESCC 患者往往腫瘤浸潤(rùn)深度越大，細(xì)胞分化程度越低，但是淋巴結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況與其他患者沒(méi)有顯著性差異。

組蛋白修飾是指N-末端發(fā)生的各種共價(jià)修飾，包括甲基化、乙?；?、磷酸化等，這些修飾能夠影響組蛋白和DNA 雙鏈的親和性，間接的導(dǎo)致表型改變。WU 等［26］運(yùn)用ESCC組織微陣列技術(shù)鑒定出lncRNA CASC9 在癌組織中高表達(dá)，并與腫瘤的大小，TNM 分期和預(yù)后密切相關(guān)；機(jī)制方面研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC9 是通過(guò)招募EZH2 改變組蛋白H3K27me3（H3K27 三甲基化）水平，抑制靶基因PDCD4 表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的。另有研究報(bào)道［27］lncRNA CCAT1 啟動(dòng)子中組蛋白H3K27 的乙?；蛊湓贓SCC 中高表達(dá)，從而發(fā)揮促癌作用。

2.4 其他調(diào)節(jié)機(jī)制 單核苷酸多態(tài)性（SNP），主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中最常見(jiàn)的一種。WU 等［13］研究了位于ESCC 易感性位點(diǎn)可能具有功能性SNP 的lincRNAs外顯子，鑒定出52個(gè)SNPs并用Logistic回歸評(píng)估了它們與ESCC 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)lincRNA-uc003opf.1外顯子中rs11752942A ＞G 位點(diǎn)的基因型頻率在患者和對(duì)照之間有顯著差異。與rs11752942AA 基因型相比，AG 和GG 基因型患ESCC 的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（OR= 0.73；95%CI =0.63～0.84）。生化分析表明，與A等位基因相比，rs11752942G等位基因可通過(guò)結(jié)合micro-RNA-149 在體內(nèi)和體外下調(diào)lincRNA-uc003opf.1 的水平，從而影響細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)表明lincRNA-uc003opf.1 外顯子中的單核苷酸多態(tài)性rs11752942A ＞G 可能是ESCC 腫瘤進(jìn)展的遺傳修飾分子。

3 LncRNA 在食管腺癌中的調(diào)控機(jī)制

相對(duì)于ESCC，對(duì)EAC 相關(guān)的lncRNA 研究較少。隨著EAC 的發(fā)病率的增加，人們對(duì)EAC 相關(guān)lncRNA 的關(guān)注度也在逐年升高。WU 等［28］運(yùn)用高分辨率深度測(cè)序技術(shù)對(duì)EAC、BE 和正常食管上皮標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA AFAP1-AS1（6 810 bp）在EAC 和BE組織中極度低甲基化。然后應(yīng)用qPCR 技術(shù)測(cè)得lncRNA AFAP1-AS1 在EAC組織和細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于正常組織和細(xì)胞，同時(shí)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)也證明這種lncRNA 在EAC 細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲中扮演重要角色。其后LUO 等［29］在ESCC 患者中做了同樣研究也發(fā)現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)的lncRNA AFAP1-AS1。ZHOU等［30］在驗(yàn)證前人基礎(chǔ)上做了Kaplan-Meier 生存分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA AFAP1-AS1 高表達(dá)的患者有較差的預(yù)后。因此lncRNA AFAP1-AS1 在ESCC 和EAC 的發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用。

YANG 等［31］對(duì)正常食管、BE 和EAC組織分別進(jìn)行了RNA-seq 分析。他們確定了有6 216 個(gè)lncRNA 在EAC 中表達(dá)，其中61 個(gè)lncRNA 在EAC 中表達(dá)上調(diào)，平均增加8 倍以上。然后選擇表達(dá)最高的lncRNA HNF1A-AS1（2 455 bp）用于進(jìn)一步研究，其在4 種EAC 細(xì)胞系（Flo-1，OE3，JHUEsoAd1 和SKGT4）表達(dá)水平明顯高于正常食管細(xì)胞（HEEpic），siRNA 沉默后可降低EAC 細(xì)胞增殖和遷移侵襲能力，也可抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展。該組研究還發(fā)現(xiàn)lncRNA HNF1A-AS1 和其同源蛋白編碼基因HNF1A 在EAC癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)都是上調(diào)的，但是沉默lncRNA HNF1A-AS1 后不能明顯影響HNF1A mRNA 和HNF1A 蛋白的表達(dá)，這說(shuō)明它們之間沒(méi)有直接的聯(lián)系。除此之外還發(fā)現(xiàn)敲除lncRNA HNF1A-AS1 后，經(jīng)典的食管癌相關(guān)lncRNA H19 表達(dá)水平顯著下調(diào)，這種lncRNAs 之間的相關(guān)性在食管癌中比較少見(jiàn)。

MAAG 等［32］運(yùn)用RNA-seq 分析技術(shù)研究了BE 在不同階段轉(zhuǎn)錄組學(xué)改變，確定了EAC 發(fā)生發(fā)展的特定基因網(wǎng)絡(luò)，并鑒定出了4 個(gè)標(biāo)記基因（CTSL，COL17A1，KLF4 和E2F3）可以用來(lái)區(qū)分EAC 與BE，同時(shí)在這個(gè)特定的基因網(wǎng)絡(luò)中找到了685 個(gè)失調(diào)的lncRNAs，這一研究結(jié)果為今后系統(tǒng)研究EAC 相關(guān)的lncRNAs 奠定了基礎(chǔ)。

4 LncRNA 在食管癌診治中的意義

食管癌由于起病隱匿，缺乏有效的早期診斷和篩查手段，大部分患者首診時(shí)已到進(jìn)展期，無(wú)法得到及時(shí)的治療，同時(shí)亦缺乏合理的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估手段，從而導(dǎo)致了不良的后果。而lncRNAs 與食管癌發(fā)生有著密切聯(lián)系，有成為食管癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物的潛力。TONG 等［33］發(fā)現(xiàn)ESCC 患者血漿中l(wèi)ncRNA POU3F3 水平明顯高于健康人群，聯(lián)合檢測(cè)血液中POU3F3 和鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCCA）對(duì)早期ESCC 的診斷有重要意義。lncRNA AF-API-AS1 在ESCC 患者中也存在高表達(dá)，并且與ESCC 的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，臨床分期以及放化療的敏感性有密切聯(lián)系［30］。lncRNA HOTAIR 也是ESCC 發(fā)展和預(yù)后的一個(gè)重要分子，CHEN 等［34］報(bào)道HOTAIR 高表達(dá)的患者常伴有癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，高TNM 分期和低生存期等比較差的預(yù)后狀況。因此，如能從lncRNAs 信息網(wǎng)絡(luò)中挖掘出可用于食管癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物，那么這將對(duì)我國(guó)食管癌的防治工作產(chǎn)生巨大影響。

5 展望

全基因組研究表明目前l(fā)ncRNAs 的已知功能僅僅是冰山一角而不是簡(jiǎn)單的信息傳遞分子，它們是具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制的分子，其延伸范圍很廣遠(yuǎn)超出我們的早期愿景。盡管lncRNA 不能編碼蛋白質(zhì)，但它們可以向下游傳遞信息并調(diào)控基因表達(dá)，所以在診斷和治療疾病上，他們作為信息傳導(dǎo)分子可能比蛋白質(zhì)更有敏感性和特異性。目前，lncRNA 的相關(guān)研究仍處于起步階段，有效應(yīng)用相關(guān)先進(jìn)技術(shù)和方案，進(jìn)一步揭開(kāi)lncRNA 與食管癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，有利于人們更好地了解lncRNAs，最終使lncRNAs應(yīng)用到食管癌的診治當(dāng)中。

在這篇綜述中，筆者總結(jié)了與食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌相關(guān)的lncRNAs，闡述了它們?cè)诟鞣N生物過(guò)程中調(diào)控機(jī)制。目前，雖然越來(lái)越多的lncRNAs 被確定為包括食管癌在內(nèi)的各種疾病的生物標(biāo)志物，但是仍然有許多關(guān)鍵性的問(wèn)題還未解決。未來(lái)應(yīng)當(dāng)加深對(duì)lncRNAs 潛在機(jī)制的研究，將研究方向逐漸從分子和細(xì)胞水平轉(zhuǎn)向食管癌動(dòng)物模型，這將有助于發(fā)現(xiàn)食管癌的新型診斷和治療方法。