1型血小板反應(yīng)蛋白7A域(THSD7A)與膜性腎病

張昌明 綜述 劉志紅 審校

膜性腎病(MN)是一種原因不明的自身免疫性疾病，其病理特征表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管基膜上皮側(cè)免疫復(fù)合物沉積，尋找MN致病抗原一直是本領(lǐng)域的核心研究工作。MN的診斷需排除系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腫瘤、感染等疾病導(dǎo)致的腎小球膜性病變。2009年，Beck等[1]發(fā)現(xiàn)M型磷脂酶A2受體(PLA2R)是多數(shù)MN患者特異性致病靶抗原。該研究發(fā)現(xiàn)約70%的MN患者血清中存在針對PLA2R的自身抗體[1]。后續(xù)系列研究發(fā)現(xiàn)PLA2R抗原或抗體可以作為MN患者疾病診斷、監(jiān)測和預(yù)測預(yù)后的新型標(biāo)志物[2-4]，也可用于指導(dǎo)MN患者個體化治療方案的選擇。但仍有少部分MN患者表現(xiàn)為PLA2R陰性。2014年，Tomas等[5]發(fā)現(xiàn)PLA2R抗體陰性的MN患者存在另一特異性致病靶抗原1型血小板反應(yīng)蛋白7A域(THSD7A)，其在MN患者中陽性率約為3%。本文就THSA7A及其抗體在MN中的作用作簡要綜述。

THSD7A抗體的發(fā)現(xiàn)

2014年，Tomas等[5]利用MN患者血清和正常腎小球提取物在非還原狀態(tài)下行免疫印跡實驗，發(fā)現(xiàn)一條分子量約為250 kD的條帶，質(zhì)譜分析和重組抗原抗體試驗證實該條帶對應(yīng)的抗原為THSD7A。在154例PLA2R抗體陰性MN患者中發(fā)現(xiàn)15例血清中存在針對THSD7A的自身抗體，而在其他腎小球疾病如局灶節(jié)段性腎小球硬化、微小病變腎病和健康人血清中均未找到該抗體，提示THSD7A抗體是MN的特異性表現(xiàn)。

THSD7A是一種I型跨膜蛋白，由1657個氨基酸構(gòu)成，分子量約250 kD，從氨基端到羧基端依次為氨基末端信號肽(47個氨基酸)、22個凝血酶敏感蛋白1型重復(fù)序列(TSR，含14個糖基化位點)、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸模序、跨膜區(qū)和短小的胞內(nèi)尾段[5]。THSD7A表達(dá)于胎盤脈管系統(tǒng)、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等，參與內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管生成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等生理過程[6-8]。全基因組關(guān)聯(lián)分析證實THSD7A基因單核苷酸多態(tài)性和肥胖及骨質(zhì)疏松癥相關(guān)[9-10]。THSD7A胞外段可以被剪切形成可溶性THSD7A，通過黏附斑激酶(FAK)依賴的方式調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成[11]。Tomas等[5]對腎活檢樣本進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)THSD7A 與足細(xì)胞足突或其附近的nephrin共定位，而不與基底膜標(biāo)志物Ⅳ型膠原和纖連蛋白共定位，也不與內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD34共定位，提示THSD7A表達(dá)于足細(xì)胞足突而不是基膜或內(nèi)皮細(xì)胞，這與PLA2R主要定位在足細(xì)胞膜表面類似。采用morpholino技術(shù)敲除斑馬魚幼魚足細(xì)胞THSD7A后，出現(xiàn)明顯的水腫、包囊擴張、足細(xì)胞數(shù)目減少、nephrin表達(dá)減少及足突融合，表明THSD7A對于維持足細(xì)胞正常功能和腎小球濾過膜完整性具有重要作用[12]。同PLA2R抗體相似，THSD7A抗體以IgG4亞型為主，僅識別非還原狀態(tài)下的THSD7A 抗原，提示抗體識別的是一種依賴于鏈間二硫鍵結(jié)構(gòu)的空間表位，推測該表位可能僅存在于某一種特定的空間結(jié)構(gòu)中[5]。

THSD7A抗體的致病機制

與PLA2R不同，THSD7A不僅表達(dá)于人類足細(xì)胞，而且表達(dá)于嚙齒類動物的足細(xì)胞，這使得人們能利用動物模型更好的研究THSD7A抗體導(dǎo)致MN的分子機制[13-14]。Tomas等[15]將THSD7A抗體陽性MN患者血清注射給小鼠，發(fā)現(xiàn)人THSD7A抗體能特異性的結(jié)合小鼠足細(xì)胞上的THSD7A，該抗體亞型為IgG4、與nephrin及THSD7A共定位；注射后3d小鼠即出現(xiàn)蛋白尿，并可持續(xù)至70d；病理形態(tài)上可觀察到IgG、C3在腎小球基膜上皮側(cè)成顆粒狀沉積，超微結(jié)構(gòu)可觀察到上皮下的電子致密物沉積和足突增寬，少數(shù)部位可觀察到足突融合。這些結(jié)果表明THSD7A抗體通過結(jié)合足細(xì)胞足突表面的THSD7A抗原，形成免疫復(fù)合物以激活補體系統(tǒng)，損傷足細(xì)胞，破壞腎小球濾過屏障，從而導(dǎo)致機體產(chǎn)生蛋白尿和MN的病理學(xué)改變[15]。同時研究者將THSD7A抗體從患者血清中純化出來，再注射給小鼠也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，進(jìn)一步證明THSD7A抗體是導(dǎo)致小鼠蛋白尿和MN的原因[15]。研究者進(jìn)一步制備了小鼠原代培養(yǎng)足細(xì)胞(GECs)并證實GECs表達(dá)THSD7A和足細(xì)胞特異性蛋白α-actinin-4。將THSD7A抗體與GECs孵育，發(fā)現(xiàn)THSD7A抗體可與GECs上的THSD7A特異性結(jié)合，通過改變GECs細(xì)胞骨架(形成應(yīng)力纖維和增強F-actin表達(dá))和黏著斑結(jié)構(gòu)(磷酸化的paxillin表達(dá)增強，并從細(xì)胞邊緣向細(xì)胞中心移動)，導(dǎo)致GECs形態(tài)改變并從培養(yǎng)板脫落，表明THSD7A抗體通過直接影響細(xì)胞骨架重組而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[15]。

THSD7A的臨床應(yīng)用價值

THSD7A抗體與MN診斷目前對THSD7A抗體的研究資料較少，初步結(jié)果顯示該抗體在MN診斷和鑒別診斷方面有如下作用：(1)幫助鑒別MN與其他腎小球疾病。在正常人群和非MN的腎小球疾病中尚未檢出THSD7A抗體[5,16-17]。在成人MN中，THSD7A抗體陽性率為1.4%～3.1%(表1)。Hoxha等[17]在一個前瞻性的MN隊列(345例)中發(fā)現(xiàn)8例THSD7A抗體陽性(2.3%)，其中PLA2R抗體陰性的患者THSD7A抗體陽性率為9.0%；回顧性的MN隊列(931例)中發(fā)現(xiàn)28例THSD7A抗體陽性(3.0%)，其中PLA2R抗體陰性的患者THSD7A抗體陽性率為3.5%～12.4%。Wang等[17]在578例中國MN患者中發(fā)現(xiàn)8例THSD7A抗體陽性(1.4%)，其中PLA2R抗體陰性的患者THSD7A抗體陽性率為9.4%；(2)幫助鑒別特發(fā)性MN (IMN)與繼發(fā)性MN(SMN)。Tomas等[5]在483例IMN患者血清中發(fā)現(xiàn)15例THSD7A抗體陽性(3.1%)，67例SMN患者中發(fā)現(xiàn)2例THSD7A抗體陽性(3.0%)，但這2例患者腎臟病理上未見SMN的表現(xiàn)，腎組織IgG亞型也以IgG4為主，很可能是MN和其他疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡和腫瘤)共存。Wang等[17]在114例SMN中發(fā)現(xiàn)1例THSD7A抗體陽性(0.9%)。由于目前研究的病例數(shù)較少，該抗體幫助鑒別IMN和SMN的結(jié)論有待進(jìn)一步證實。

THSD7A抗體與MN預(yù)后初步研究結(jié)果表明血清THSD7A抗體與MN疾病活動性相關(guān)[5,16-17]。Tomas等[5]報道2例大量蛋白尿的MN患者，免疫抑制劑治療后隨著THSD7A抗體水平下降，蛋白尿水平下降，而另一例患者持續(xù)高水平的THSD7A抗體則伴隨著持續(xù)大量蛋白尿。Hoxha等[16]對11例血清THSD7A抗體陽性的患者進(jìn)行了至少1年的隨訪，發(fā)現(xiàn)1例患者在9個月時進(jìn)入ESRD，5例THSD7A抗體轉(zhuǎn)陰的患者中4例達(dá)到完全緩解，1例部分緩解，而5例THSD7A抗體持續(xù)陽性的患者蛋白尿僅部分緩解或無緩解。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)2例THSD7A抗體陽性的MN患者達(dá)到完全緩解時該抗體轉(zhuǎn)陰，而蛋白尿復(fù)發(fā)時該抗體再次出現(xiàn)。但是THSD7A抗體滴度與蛋白尿程度并不相關(guān)，也不能預(yù)測MN的治療反應(yīng)。Sharma等[18]發(fā)現(xiàn)10例THSD7A抗體滴度1∶ 10的患者平均蛋白尿為10.1 g/d(范圍2.8～23 g/d)，9例有隨訪的患者中僅1例蛋白尿部分緩解，其余均無緩解；11例抗體滴度1∶ 100的患者平均蛋白尿為10.5 g/d(范圍3～15 g/d)，7例有隨訪的患者中2例完全緩解，2例部分緩解，其余3例無緩解；3例抗體滴度1∶ 500的患者平均蛋白尿為9.2 g/d(范圍2.4～15.9 g/d)，治療后均無緩解。以上研究結(jié)果提示THSD7A抗體與MN預(yù)后相關(guān)，但仍需前瞻性、大樣本的臨床研究來證實。

THSD7A抗體與MN移植后復(fù)發(fā)血清THSD7A抗體水平還與MN移植后復(fù)發(fā)概率有關(guān)。2016年，《Journal of Clinical Investigation》雜志報道了一例因MN進(jìn)展至ESRD而行腎移植的老年男性患者，回顧檢測其移植前血清標(biāo)本發(fā)現(xiàn)高滴度THSD7A抗體、腎小球THSD7A染色陽性，而血清PLA2R抗體及腎小球PLA2R染色均陰性；移植后1年再次出現(xiàn)大量蛋白尿，行移植腎活檢提示MN復(fù)發(fā)，腎小球THSD7A染色陽性而PLA2R染色陰性，血清THSD7A抗體也呈現(xiàn)高滴度陽性，而PLA2R抗體陰性，提示血清THSD7A抗體水平可以幫助預(yù)測MN患者移植后復(fù)發(fā)風(fēng)險，具有高滴度THSD7A抗體者可能需要更加積極的免疫抑制治療[15]。

腎小球THSD7A表達(dá)與MN THSD7A抗原存在于MN患者腎小球上皮側(cè)免疫復(fù)合物中，血清中未檢出游離的THSD7A抗原或者THSD7A-THSD7A抗體免疫復(fù)合物，證實腎小球上皮側(cè)的免疫復(fù)合物為原位形成[5]。在正常人腎小球僅能觀察到微量的線性分布的THSD7A信號，在MN患者中則能觀察到沿血管袢分布的顆粒狀THSD7A染色增強[5,15]。同PLA2R相關(guān)性MN相似[3,19-20]，腎小球免疫復(fù)合物中THSD7A染色和血清THSD7A抗體之間并不是完全平行的關(guān)系。部分血清THSD7A抗體陰性的患者，仍然可以觀察到腎小球THSD7A染色特異性增強，表明腎組織THSD7A染色比血清THSD7A抗體水平檢測具有更高的敏感度，可提高THSD7A相關(guān)性MN患者的診斷精確度[16,21]。

MN患者腎組織THSD7A染色陽性率見表1。Hoxha等[16]在65例未使用免疫抑制劑治療的MN患者中發(fā)現(xiàn)7例THSD7A染色陽性(10.8%)。Wang等[17]在578例中國MN患者中發(fā)現(xiàn)12例THSD7A染色陽性(2.1%)，其中2例THSD7A/PLA2R雙陽性(0.3%)；64例PLA2R染色陰性的患者中有10例THSD7A染色陽性(15.6%)。Lin等[21]在136例MN患者中發(fā)現(xiàn)5例THSD7A染色陽性(3.7%)，其中3例血清THSD7A抗體也是陽性的。Sharma等[18]在1 318例MN患者中發(fā)現(xiàn)31例THSD7A染色陽性(2.4%)。Larsen等[22]在258例MN患者中發(fā)現(xiàn)9例THSD7A染色陽性(3.5%)，其中2例THSD7A/PLA2R雙陽性(0.8%)。Iwakura等[23]在55例日本MN患者中發(fā)現(xiàn)5例THSD7A染色陽性(9.1%)，而37例SMN患者中THSD7A染色均陰性。Qin等[3]在53例血清PLA2R抗體及腎組織PLA2R染色均陰性的MN患者中發(fā)現(xiàn)4例THSD7A染色陽性(7.5%)。

THSD7A相關(guān)性MN的特點

THSD7A被發(fā)現(xiàn)后，不斷有學(xué)者將THSD7A抗原或抗體陽性的MN統(tǒng)稱為THSD7A相關(guān)性MN[5,16,22,25]。與PLA2R相關(guān)性MN相比，THSD7A相關(guān)性MN患者中女性比例更高(57%)，而年齡、蛋白尿、估算的腎小球濾過率或血清肌酐水平相當(dāng)[5,16]。值得注意的是，約有20%的THSD7A相關(guān)性MN患者在隨訪過程中(中位隨訪時間3個月)被檢出患有惡性腫瘤[16]。而經(jīng)過腫瘤切除、化療后隨著血清THSD7A抗體水平下降，蛋白尿水平亦下降[26]。與不伴腫瘤的患者相比，伴有腫瘤的THSD7A相關(guān)性MN患者腎小球炎癥細(xì)胞浸潤更多，而IgG4陽性率及其他病理學(xué)表現(xiàn)兩者無差異[16]。據(jù)此研究者提出了一種新的理論：免疫系統(tǒng)識別腫瘤組織的THSD7A而產(chǎn)生THSD7A抗體，后者與足細(xì)胞THSD7A結(jié)合而形成原位免疫復(fù)合物，導(dǎo)致MN發(fā)生[16]。之后Lin等[27]報道了一例THSD7A相關(guān)性MN伴1型神經(jīng)纖維瘤的病例。然而近期發(fā)表的兩項研究結(jié)果則與此不同。Sharma等[18]觀察了31例THSD7A相關(guān)性MN的臨床病理特點，發(fā)現(xiàn)THSD7A相關(guān)性MN以男性為主(61%)，腫瘤發(fā)生率僅為6%，均發(fā)生于MN診斷之前，在平均12個月的隨訪過程中沒有發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤。Wang等[17]對12例THSD7A相關(guān)性MN患者進(jìn)行了嚴(yán)密的腫瘤篩查，在平均23個月的隨訪過程中也沒有發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤。這種差異存在的原因尚不明確。盡管如此，這一現(xiàn)象仍值得我們關(guān)注，提醒我們對THSD7A相關(guān)性MN患者要進(jìn)行周密的腫瘤篩查。

THSD7A：1型血小板反應(yīng)蛋白7A域；WB：免疫印記法；IFT：間接免疫熒光法；IHC：免疫組化；IF：免疫熒光；IMN：特發(fā)性膜性腎病；SMN：繼發(fā)性膜性腎病；IS：免疫抑制劑；PLA2R：磷脂酶A2受體

THSD7A相關(guān)性MN研究方法進(jìn)展

血清THSD7A抗體的檢測方法包括：免疫印跡法(WB)和間接免疫熒光法(IFT)。WB法結(jié)果可靠，但是操作步驟繁瑣，不適用于大樣本高通量的臨床研究。與WB法相比，IFT法操作簡單，特異性為100%，敏感性為92%[16]，但尚不能夠準(zhǔn)確定量，且受觀察者主觀性的影響[28-29]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法操作簡便快速，能夠進(jìn)行精確定量，檢測結(jié)果不受檢查者主觀性的影響，與WB和IFT法具有相似的敏感性和特異性，是多種血清抗體理想的檢測方法[30-31]，但目前尚無商品化的血清THSD7A抗體ELISA檢測試劑盒用于研究抗體水平和臨床指標(biāo)及預(yù)后之間的關(guān)系[32]。腎組織THSD7A的檢測方法包括免疫組化法(IHC)和免疫熒光法(IF)，其中IHC方法使用較多。

如前文所述，MN患者THSD7A抗體檢出率不高，使得人們很難得到足夠的THSD7A抗體陽性血清用于更深入系統(tǒng)的研究。為解決這一問題，Tomas等[12]制備了兔抗人THSD7A抗體，并證實該抗體能誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生MN，從而建立了一種異源性的小鼠THSD7A相關(guān)性MN模型。該模型可幫助人們進(jìn)一步研究MN分子機制并尋找新的治療策略。此外該抗體能與C57BL/6、DBA/J1小鼠和Sprague-Dawley大鼠的腎小球濾過膜結(jié)合，但并不能誘導(dǎo)蛋白尿，表明遺傳背景在該模型中具有重要作用。

小結(jié)：隨著MN致病靶抗原的不斷發(fā)現(xiàn)，IMN這一名詞不斷受到挑戰(zhàn)，逐漸被PLA2R相關(guān)性MN，THSD7A相關(guān)性MN，靶抗原不明的MN和SMN所取代[25,33]。THSD7A抗體和抗原檢測在MN中的作用的研究較少，但有限的研究結(jié)果已顯示出其在MN診斷、預(yù)后判斷和病情監(jiān)測等方面的潛在應(yīng)用價值。值得注意的是THSD7A相關(guān)性MN患者腫瘤發(fā)生率較高，后續(xù)需大樣本的研究驗證這一現(xiàn)象。動物模型、足細(xì)胞損傷模型和商品化的血清THSD7A抗體檢測試劑盒的面世有助于更深入、高效的闡明THSD7A在足細(xì)胞中的功能，以幫助我們更好地理解MN的發(fā)病機制及制定對應(yīng)的治療方案。

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