植物細(xì)胞器內(nèi)蛋白質(zhì)量控制相關(guān)機(jī)理綜述

韓薛婧娉，胡盈盈，余 穎，王炫婷，徐 珂，祝妍瑾

（浙江師范大學(xué)初陽學(xué)院，浙江金華321000）

蛋白質(zhì)是生物體生命活動的執(zhí)行者，其結(jié)構(gòu)和活性決定了功能強(qiáng)弱，最終影響生物體的活動。許多mRNA翻譯出的多肽鏈不具有生理活性，需要折疊、組裝成大分子蛋白質(zhì)后才能在特定位點(diǎn)發(fā)揮其生物學(xué)功能。蛋白質(zhì)翻譯過程出錯或蛋白質(zhì)損傷是生物體內(nèi)普遍發(fā)生的現(xiàn)象，但蛋白質(zhì)受損更多情況下是由植物體內(nèi)積累活性氧（ROS）的攻擊引起的，葉綠體、線粒體和過氧化物酶體等細(xì)胞器均能產(chǎn)生ROS。葉綠體光合代謝中，O2首先在光系統(tǒng)Ⅰ被還原為，在超氧化物歧化酶（SOD）的歧化作用下產(chǎn)生H2O2，H2O2如不能被及時清除，則會在Fe2+或Cu2+作用下，反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基（·OH）[1]。線粒體中，電子沿著電子傳遞鏈傳遞給末端氧化酶之前，離開呼吸鏈而與氧反應(yīng)生成超氧自由基的過程是線粒體產(chǎn)生ROS的主要來源[2]。過氧化物酶體中，膜上NADH和NADPH受驅(qū)動會產(chǎn)生O2-，基質(zhì)中，黃嘌呤氧化酶（XOD）催化黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的反應(yīng)中也會產(chǎn)生O2-，此外，芬頓反應(yīng)（Fenton reaction）能產(chǎn)生·OH 和單線態(tài)氧（1O2）[3]。

植物在自然生長條件下極易受到干旱、鹽、熱等非生物脅迫，此時，植株內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除平衡被打破，ROS大量積累[4]，由此引起植物細(xì)胞器甚至細(xì)胞的損傷和死亡，進(jìn)而影響植物的正常生長發(fā)育。在農(nóng)業(yè)上，嚴(yán)重的非生物脅迫可能導(dǎo)致作物生長緩慢、產(chǎn)量低下，影響經(jīng)濟(jì)效益。

為了確保蛋白質(zhì)的正常折疊、組裝、運(yùn)輸和異常蛋白的修復(fù)、降解，植物體內(nèi)存在嚴(yán)格的蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)，以維持蛋白質(zhì)的動態(tài)平衡。由于細(xì)胞器在細(xì)胞中扮演著非常重要的角色，因此，細(xì)胞器內(nèi)蛋白質(zhì)量控制也顯得尤為重要。當(dāng)細(xì)胞器蛋白受到活性氧攻擊而出現(xiàn)損傷時，植物細(xì)胞器蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)主要通過修復(fù)氧化蛋白和水解無法修復(fù)的蛋白2種途徑來保護(hù)自身正常生長。

1 植物細(xì)胞器蛋白氧化損傷及檢測

1.1 細(xì)胞器蛋白氧化損傷方式

ROS對蛋白質(zhì)的氧化損傷體現(xiàn)在很多方面，ROS能使蛋白質(zhì)巰基氧化成二硫鍵（P-S-S-P）和谷胱甘肽二硫鍵（P-S-S-G），因此，多數(shù)催化中心為巰基的蛋白質(zhì)失活。此外，氧化蛋白可能含有活性基團(tuán)，因而，有機(jī)會造成其他生物分子的二次氧化損傷[5]。ROS對蛋白質(zhì)的損傷機(jī)理主要有5個方面：修飾氨基酸，斷裂肽鏈，形成交聯(lián)聚合物，改變構(gòu)象和產(chǎn)生免疫原性。

1.1.1 修飾氨基酸 不同自由基會特異性修飾氨基酸，其中，含不飽和鍵的氨基酸對氧化損傷特別敏感，且氨基酸被破壞的程度與自由基的摩爾濃度呈正相關(guān)[6]?！H是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，幾乎能與所有的氨基酸反應(yīng)，如可氧化精氨酸（Arg）為谷氨酸（Glu）或谷氨酸半醛殘基等[7]。

1.1.2 斷裂肽鏈 自由基主要通過水解肽鍵和直接斷裂2種方式導(dǎo)致肽鏈斷裂。自由基攻擊氨基酸的肽鍵可導(dǎo)致其共價鍵解開，以含脯氨酸（Pro）的肽鏈為例，ROS的攻擊會導(dǎo)致羰基生成，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為α-吡咯烷酮，α-吡咯烷酮水解后便與相鄰氨基酸斷開。肽鏈直接斷裂過程為·OH在有氧參與時，帶走α碳原子上的H，形成過氧基，酸性條件下，肽鍵轉(zhuǎn)變成亞氨基肽，水解斷裂[8]。

1.1.3 形成交聯(lián)聚合物 多種機(jī)制均可導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚合。如：被氧化后，酪氨酸（Tyr）形成二酪氨酸，半肽氨酸（Cys）生成二硫鍵，均可以使蛋白質(zhì)交聯(lián)聚合[9]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)接觸·OH后，生成大量雙酪氨酸，且可以交聯(lián)方式與Tyr和Cys數(shù)目密切相關(guān)。

1.1.4 改變構(gòu)象 蛋白質(zhì)氧化修飾過程常伴隨肽鍵斷裂、蛋白分子交聯(lián)聚合等過程，其分子結(jié)構(gòu)在熱動力學(xué)上不穩(wěn)定，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)失活。研究發(fā)現(xiàn)，·OH可改變谷氨酞胺合成酶的高級結(jié)構(gòu)[10]。

1.1.5 蛋白質(zhì)免疫學(xué)性質(zhì)的改變 活性氧可引起免疫反應(yīng)增強(qiáng)，其原因可能是ROS與自身某些免疫性疾病中抗原抗體復(fù)合物的形成有關(guān)[8]。

1.2 蛋白質(zhì)量檢測指標(biāo)

為了判斷蛋白質(zhì)量，比較常用的指標(biāo)有羰基化蛋白質(zhì)量、游離巰基含量、蛋白質(zhì)分子表面疏水性、蛋白內(nèi)源熒光光譜、蛋白聚集程度等。

在引起蛋白質(zhì)氧化損傷的反應(yīng)中，肽骨架斷裂、氨基酸側(cè)鏈氧化等都與新生成的蛋白質(zhì)羰基有關(guān)，自由基氧化多肽成羰基這一現(xiàn)象比較普遍，因此，羰基含量被作為判斷蛋白質(zhì)氧化損傷程度的一個重要指標(biāo)[11-12]。在穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子構(gòu)象上，二硫鍵和巰基發(fā)揮了非常重要的作用[13]，氧化可以改變巰基/二硫鍵交互反應(yīng)的平衡常數(shù)，也能改變蛋白質(zhì)分子中巰基和二硫鍵的比例及分布[14]，游離巰基含量由此可作為評價蛋白質(zhì)氧化水平的指標(biāo)。表面疏水性對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和功能特性有重要影響[15]，因此，可用來衡量蛋白質(zhì)變性程度，不僅反映表面疏水性基團(tuán)的相對含量，還反映蛋白位點(diǎn)的細(xì)微變化。蛋白熒光反映蛋白質(zhì)量，尤其體現(xiàn)在最容易被氧化的色氨酸（Ser）上，Ser殘基極易被轉(zhuǎn)化為亞穩(wěn)態(tài)的自由基、過氧自由基、犬尿氨酸，使得內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降[16]。蛋白聚集程度也是體現(xiàn)蛋白質(zhì)量的一個指標(biāo)，可通過蛋白質(zhì)的溶解度來進(jìn)行簡單表征。

2 植物細(xì)胞器氧化蛋白修復(fù)

合適的生理環(huán)境是細(xì)胞生存和發(fā)揮功能的必要條件，在維持著體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)方面，硫氧還蛋白家族有重要作用。該家族包括蛋白質(zhì)谷氧還蛋白（GRX）、硫氧還蛋白（TRX）和二硫鍵異構(gòu)酶（PDI），其中前兩者更為重要[17]。由于自身氧化還原電位不同，生物體內(nèi)GRX和TRX多作為還原劑，而PDI多作為氧化劑。

2.1 谷氧還蛋白系統(tǒng)

該系統(tǒng)由GRX、還原型輔酶Ⅱ（NADPH）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽（GSH）構(gòu)成。電子從NADPH向GR，GSH傳遞，最后到GRX。谷氧還蛋白通過還原過氧化氫酶、脫氫抗壞血酸[18]等多種途徑介入氧化應(yīng)激過程。

GRX依賴于GSH催化巰基-二硫鍵的轉(zhuǎn)換反應(yīng)，對和GSH相連的二硫化物有高度的底物特異性。GRX催化機(jī)制可分為單巰基催化和二巰基催化2種。單巰基催化指GRX催化還原與GSH相連的二硫鍵，N端Cys的巰基作用于目的蛋白二硫鍵，生成反應(yīng)中間體P-SH和GRX-S-S-G，后者的二硫鍵被第2個分子的GSH還原，生成GRXreduced和GSSG。二巰基催化指GRX催化還原蛋白質(zhì)二硫鍵，GRX活性中心N端Cys的巰基作用于二硫鍵，生成中間產(chǎn)物，GRX的C端Cys的巰基攻擊產(chǎn)物的二硫鍵，生成P-SH和GRXoxidized。GSH攻擊后者分子內(nèi)二硫鍵，GSH和活性中心N端Cys的巰基新生成二硫鍵，形成GRX-S-S-G復(fù)合物。最后，GSH攻擊復(fù)合物的二硫鍵，生成GSSG和GRXreduced。

2.2 硫氧還蛋白系統(tǒng)

TRX在氧脅迫反應(yīng)中作用很大，它可還原具有修復(fù)氧化蛋白功能的酶，如過氧化物酶、蛋氨酸硫氧化物還原酶等。

硫氧還蛋白系統(tǒng)由NADPH、硫氧還蛋白還原酶（TR）、硫氧還蛋白構(gòu)成。TR可催化氧化型的TRX被還原。真核細(xì)胞中的TRX被一種依賴于NADPH的TR（NTR）還原；在色素體和藍(lán)細(xì)菌中，TRX被依賴于FAD的TR（FTR）還原。

TRX催化反應(yīng)過程主要為：活性中心N端的巰基攻擊目的蛋白的二硫鍵，形成中間體TRX-protein，后被C端的巰基還原，生成氧化態(tài)TRX和還原態(tài)目的蛋白，TRX最后被相應(yīng)的還原酶還原。

3 植物細(xì)胞器氧化蛋白清除

3.1 氧化蛋白的酶降解

受到損傷的蛋白質(zhì)需要通過蛋白酶除去。蛋白酶廣泛分布于生物細(xì)胞中，主要作用對象是肽鍵，作用包括五大類：清除錯誤折疊、修飾和定位的蛋白；供給氨基酸；激活酶原；調(diào)控關(guān)鍵酶及調(diào)節(jié)蛋白含量；除去已定位蛋白信號。在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中行使降解氧化蛋白質(zhì)功能的主要是26S蛋白酶體，在細(xì)胞器中行使該功能的蛋白酶有ClpP蛋白酶、Lon蛋白酶等。

3.1.1 ClpP蛋白酶 ClpP蛋白酶廣泛存在于各種生物體中，目前在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)了6個ClpP蛋白異構(gòu)體（ClpP1-6），其中，僅ClpP2定位于線粒體，其他均在葉綠體中。

ClpP需要與分子伴侶（如ClpA，ClpE和ClpX等）組合成復(fù)合物，才能發(fā)揮蛋白酶的作用：捕獲目的蛋白，利用ATP高能磷酸鍵斷裂產(chǎn)生能量將底物蛋白結(jié)構(gòu)松散后轉(zhuǎn)移至ClpP，將多肽水解為小的肽段后釋放。此外，Clp復(fù)合物的2個亞基分離時也可發(fā)揮一定功能。

3.1.2 Lon蛋白酶 Lon蛋白酶是細(xì)胞器中蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的最主要成分，高度保守，具有分子伴侶及調(diào)控蛋白質(zhì)降解等功能。

擬南芥中存在4個Lon蛋白酶，分別為Lon1，Lon2，Lon3和Lon4蛋白酶。其中，Lon1和Lon4蛋白酶既定位于線粒體中，又定位于葉綠體中，參與線粒體功能的維護(hù)以及ABA信號途徑中的蛋白降解、葉綠體自愿響應(yīng)和幫助抵御干旱脅迫；Lon2定位于過氧化物酶體中，研究表明，Lon2蛋白酶可有效清除過氧化物酶體中的氧化蛋白質(zhì)，且可能還具有調(diào)控過氧化物酶體中抗氧化酶酶活的能力；Lon3為假基因，是Lon基因家族成員中唯一具有潛在核定位信號的基因。

3.2 自體吞噬空泡對氧化蛋白的清除

除酶降解外，植物細(xì)胞器氧化蛋白清除還有一個重要途徑是細(xì)胞自噬，該途徑對氧化蛋白具有較高的清除效率。自體吞噬是指細(xì)胞質(zhì)的成分在液泡或溶酶體中被降解的過程，其分子機(jī)制在高等真核生物中保守性較高。自體吞噬包含微型和巨型2種主要形式。微型自體吞噬指細(xì)胞質(zhì)的成分被胞吞進(jìn)入細(xì)胞器，即溶酶體或者液泡內(nèi)膜直接包裹底物并降解。巨型自體吞噬則是胞質(zhì)成分先由雙層膜結(jié)構(gòu)包圍，形成自吞噬體，之后其外膜與溶酶體、液泡膜融合，通過胞吞方式進(jìn)入溶酶體或液泡中，最終將其降解。

4 總結(jié)與展望

植物細(xì)胞器在受到脅迫時將產(chǎn)生大量活性氧，不僅損傷細(xì)胞器自身，活性氧還可通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對細(xì)胞其他部位產(chǎn)生影響。蛋白質(zhì)是極易受氧化損傷的生物大分子，其損傷將嚴(yán)重影響細(xì)胞器甚至細(xì)胞的正常生命活動。目前，植物細(xì)胞器中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種蛋白質(zhì)量控制方式。但由于蛋白質(zhì)量控制的復(fù)雜性，許多具體機(jī)制仍處于研究探索階段，尚不完整。此外，細(xì)胞器水平的蛋白質(zhì)量控制與細(xì)胞水平的蛋白修復(fù)和清除機(jī)制之間的內(nèi)在聯(lián)系也尚未研究清楚。這些相關(guān)機(jī)制的深入探究和完善將為農(nóng)作物育種等方面的研究提供理論參考。