脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白生物學(xué)功能及其在小麥中的研究進(jìn)展

魯晉秀 ，閆秋艷 ，李 倩 ，聶園軍 ，楊 峰

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西臨汾041000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟(jì)研究所，山西太原030006）

植物脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（lipid transfer protein，LTP）是一類可溶性的小分子蛋白，因其能夠轉(zhuǎn)運(yùn)脂類物質(zhì)而得名。LTP蛋白N端有一個包含21～29個氨基酸的信號肽，能夠引導(dǎo)蛋白分泌到細(xì)胞外參與細(xì)胞外親脂性物質(zhì)（如角質(zhì)）的沉積途徑[1]。LTP蛋白含有8個半胱氨酸殘基（C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXCXn-C-Xn-C），可以形成4個二硫鍵[2]。體外試驗(yàn)表明，這4個二硫鍵形成一個疏水腔，因而能夠結(jié)合脂類和一些疏水性物質(zhì)[3]。不同物種的LTP蛋白一級結(jié)構(gòu)差異較大，根據(jù)其分子量大小最初將其分為LTP I和LTP II共2個亞家族，其中，LTP I分子質(zhì)量大約為10 ku，由90～95個氨基酸殘基組成；LTP II分子質(zhì)量大約為7 ku，由70個氨基酸組成。2個亞家族都含有保守的8個半光氨基酸殘基，其形成二硫鍵的配對方式不同：LTP I家族中半胱氨酸殘基配對組合為 1-6，2-3，4-7 和 5-8，LTP II家族中半胱氨酸殘基配對組合為1-5，2-3，4-7和6-8。后來在玉米中發(fā)現(xiàn)了花藥特異性轉(zhuǎn)錄基因MZm3-3，該基因表達(dá)的蛋白與nsLTPs同源，被認(rèn)為是TypeIII[4]。BOUTROT等[5]通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析將水稻和擬南芥的nsLTPs分為9種類型（type），不同類型可以通過8個半胱氨酸之間的氨基酸數(shù)目來區(qū)分。

1 LTP研究進(jìn)展

1.1 LTP克隆

植物L(fēng)TP首次從菠菜葉中分離[6]，隨后其他不同植物L(fēng)TP成員也相繼被報(bào)道。目前，已經(jīng)從多種植物中分離到LTPs基因，在小麥中鑒定出23個LTP基因[7]，在棉花中已分離到11個LTP基因[8]，在擬南芥中分離到15個LTP基因[9]，而近來對水稻全基因組序列的分析發(fā)現(xiàn)，在水稻中存在52個脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[5]。

1.2 LTP定位和表達(dá)

脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是在植物中發(fā)現(xiàn)的一類小分子蛋白家族，其細(xì)胞定位也比較復(fù)雜，免疫定位研究表明，AtLTP1存在于細(xì)胞壁中[10]，在玉米胚芽鞘的表皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有LTP的存在[11]。

通過Northern blot實(shí)驗(yàn)、原位雜交以及對轉(zhuǎn)基因植物中LTP-GUS融合蛋白的GUS活性檢測等技術(shù)，對LTP的表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同植物L(fēng)TP在時間和空間上表現(xiàn)出復(fù)雜的表達(dá)模式，同一植物的不同LTP可能有其特有的表達(dá)模式。在大麥中發(fā)現(xiàn)的2個幼苗特異性表達(dá)LTP基因，一個在幼苗葉片中的表達(dá)量要高于胚芽鞘，而另一個表達(dá)恰好相反[12]。蓖麻中l(wèi)tpC1和ltpC2在子葉中表達(dá)，而ltpD則在胚軸中表達(dá)[13]。通過研究發(fā)現(xiàn)，LTP主要存在于植物的地上部分，如植物的葉、莖和芽的分生組織中，但在根中沒有檢測到LTP基因的表達(dá)[6，14-15]。

有研究在青花菜中發(fā)現(xiàn)，LTP與葉片中角質(zhì)層蠟質(zhì)合成有關(guān)，免疫分析發(fā)現(xiàn)其蛋白的50%在幼葉中表達(dá)，隨著葉片的老化蛋白含量降低至4%，上述結(jié)果表明，LTP和轉(zhuǎn)運(yùn)角質(zhì)單體以及角質(zhì)合成有關(guān)[16]。對AtLTP1基因的研究也表明，其在正在發(fā)育的幼嫩組織中的表達(dá)量要高于成熟的組織[17]，在胡蘿卜的胚胎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的EP2基因?qū)儆贚TP家族，該基因在胚細(xì)胞、莖尖、發(fā)育的花以及成熟種子的種皮和果皮中表達(dá)，有運(yùn)輸角質(zhì)單體的功能，這對形成胚的脂質(zhì)層是非常必要的[18]。

在植物花和花器官中也檢測到有LTP基因的表達(dá)，比如LTP基因在擬南芥正在發(fā)育的花序中有較高的轉(zhuǎn)錄水平，研究還發(fā)現(xiàn)，在煙草的萼片[14]、花椰菜的花蕾[15]以及油菜籽的小孢子[19]中都有LTP基因的表達(dá)。

1.3 LTP生物學(xué)功能

1.3.1 角質(zhì)層蠟質(zhì)合成和胚胎發(fā)育 由于信號肽的存在，使得蛋白能夠分泌到細(xì)胞外參與親脂性物質(zhì)比如角質(zhì)的沉積，LTP蛋白能夠結(jié)合?；渾误w，這在角質(zhì)合成過程中起到重要作用[1]。擬南芥中發(fā)現(xiàn)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LTPG參與角質(zhì)的合成，該基因突變導(dǎo)致莖表皮細(xì)胞角質(zhì)層蠟質(zhì)組成發(fā)生變化以及蠟質(zhì)積累減少[20]。煙草中LTP基因表達(dá)量上升，從而使葉片的角質(zhì)層蠟質(zhì)積累增加[21]。上述結(jié)果均表明，LTP參與植物角質(zhì)層蠟質(zhì)運(yùn)輸和積累。研究發(fā)現(xiàn)，LTP在幼胚中有很高的表達(dá)量，推測LTP可能在胚胎發(fā)育早期保護(hù)層形成中起到重要作用[18]。1.3.2 生殖器官發(fā)育 ARIIZUMI[22]在花粉發(fā)育階段的絨氈層細(xì)胞檢測到擬南芥脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtLTP12基因的表達(dá)，認(rèn)為該基因能夠在花粉發(fā)育過程中從絨氈層向花粉外壁傳遞脂質(zhì)。水稻OsC6編碼一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，在絨氈層細(xì)胞中有很高的表達(dá)量。研究發(fā)現(xiàn)，RNAi干擾OsC6基因表達(dá)，轉(zhuǎn)基因水稻的花藥細(xì)胞表現(xiàn)出絨氈層不能降解，從而降低了花粉的育性[23]。

1.3.3 病原菌的防御 LTPS蛋白與植物抗病相關(guān)，在受到病原菌誘導(dǎo)時基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，其蛋白能使植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性[24]。例如，從大麥葉片中得到的純化LTP-like蛋白以及從玉米中分離出的LTP對細(xì)菌性病原體和真菌生長起到了抑制作用。在煙草中過表達(dá)小麥ltp3F1，能夠提高煙草對真菌病害的抗性。SUN等[25]研究認(rèn)為，LTP能夠結(jié)合磷脂使真菌病原體的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變。MALDONADO等[26]通過篩選一系列擬南芥突變體是否產(chǎn)生SAR特異應(yīng)答時，得到了1個對假單胞菌有局部抗性的缺陷型誘導(dǎo)抗性基因dir1-1，其中，dir1-1編碼LTP，因此，推測DIR1能夠和脂類物質(zhì)相互作用，促進(jìn)信號遠(yuǎn)距離傳導(dǎo)，進(jìn)而表現(xiàn)為對病原體的抗性。但在近期的研究中發(fā)現(xiàn)，擬南芥中AtLTP3能夠增加體內(nèi)ABA的合成，從而提高植株對病原菌的易感性[27]。

1.3.4 抗非生物脅迫 已有研究證明，LTP與植物防御反應(yīng)激發(fā)子elicitin[28]在結(jié)構(gòu)和功能特性上有些類似，能夠與植物控制防御反應(yīng)的受體相結(jié)合，因此可推測脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物受到脅迫反應(yīng)的早期即發(fā)揮作用。作為一種防御蛋白，LTP基因的表達(dá)量常受到干旱、鹽脅迫等處理的影響。比如，芝麻SiLTP2與SiLTP4基因的表達(dá)受NaCl、甘露醇等脅迫的誘導(dǎo)[29]。擬南芥中過表達(dá)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AZI1株系的耐鹽性明顯高于野生型和突變體株系[30]。干旱處理后的雀麥草LTP基因在復(fù)水3 d后表達(dá)量加倍[31]。過表達(dá)辣椒CALTP1的轉(zhuǎn)基因擬南芥抗鹽和抗旱性能比野生型顯著提高[32]。

2 LTP在小麥中的研究動態(tài)

2.1 表達(dá)譜的研究

LTP作為小分子家族，在基因序列上保守，其基因表達(dá)上卻表現(xiàn)各異，例如JANG等[33]在小麥-黑麥易位系2BS/2RL中克隆到2個LTP家族基因LTP1和LTP2，Northern blot分析表明，在植株的葉片、莖和花冠中表達(dá)，原位雜交進(jìn)一步表明，LTP1和LTP2在葉片細(xì)胞的維管束和花冠細(xì)胞的維管束組織層中表達(dá)。BOUTROT等[7]用GUS作為報(bào)告基因，同樣在轉(zhuǎn)基因水稻根、葉和花的維管組織中檢測到6個小麥LTP基因啟動子活性，進(jìn)一步說明，LTP在維管組織中發(fā)揮一定作用。YU等[34]從小麥3B，3D和5D染色體上分離出3個I類型的LTP基因，研究表明，這3個基因在轉(zhuǎn)基因煙草的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，同時還發(fā)現(xiàn)，TaLTPId.1在葉綠體中也有少量表達(dá)。

2.2 生物脅迫的研究

LTP家族蛋白長期以來被歸類為PR（pathogenesis-related）家族的成員，因此，其在植物防御病原菌方面發(fā)揮一定作用[35]。例如SUN等[25]從小麥中克隆了9個ns-LTP基因的cDNA，研究發(fā)現(xiàn)，它們在體外能夠抑制致病病原菌的生長；過表達(dá)TaLTP5基因的轉(zhuǎn)基因小麥對赤霉病和根腐病具有一定的抗性[36]。過表達(dá)小麥脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TdLTP4的擬南芥對真菌抗性有顯著提高[37]。目前有研究表明，并不是所有家族成員均有抗病性作用，如TaDIR1-2基因，與擬南芥脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtDIR1同源，通過基因沉默的方法敲除小麥中TaDIR1-2基因，結(jié)果顯示，該轉(zhuǎn)基因小麥對條銹病的抗性顯著增加，表明TaDIR1-2基因通過改變ROS或者水楊酸信號途徑對抗病性起到負(fù)調(diào)控作用[38]。

2.3 抗非生物脅迫研究

LTP作為一種防御蛋白，在小麥中同樣被檢測到在植株抵抗非生物脅迫過程中發(fā)揮一定作用。JANG 等[33，39]通過 Northern blot分析表明，LTP1 和LTP2基因在ABA和冷脅迫處理植株24 h后表達(dá)量升高，干旱處理3 d后表達(dá)量升高。原位雜交試驗(yàn)進(jìn)一步表明，在植株花冠細(xì)胞的維管束組織層中干旱處理植株的基因表達(dá)量高于對照植株，認(rèn)為由于植株缺水導(dǎo)致維管束組織層被破壞，而LTP基因此時表達(dá)量升高，從而推測在干旱脅迫下LTP能夠保護(hù)維管束組織層細(xì)胞。YU等[34]分離出3個I類型家族的LTP基因，研究表明，TaLTPIb.1和TaLTPIb.5基因在受到干旱和冷脅迫后表達(dá)量均升高，而在黑暗處理后表達(dá)量不變，而TaLTPId.1在黑暗處理后表達(dá)量卻有上升趨勢。進(jìn)一步研究表明，在過表達(dá)擬南芥中發(fā)現(xiàn)，冷脅迫條件下增加了3個轉(zhuǎn)基因植株的根長，TaLTPId.1基因在表達(dá)上的不同可能是因?yàn)榧易寤騺喒δ芑脑?。HELA等[37]從小麥中分離的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TdLTP4，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在NaCl，ABA，JA和H2O2脅迫過程中比野生型表現(xiàn)優(yōu)越，過量表達(dá)小麥TaLTP3的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐熱性和氧化應(yīng)激反應(yīng)比野生型有所提高[40]。LI等通過同源克隆在小麥中獲得LTP基因，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn)，該基因能夠提高植株抗鹽脅迫能力[41]。

3 展望

小麥?zhǔn)鞘澜缟现饕募Z食作物之一，在我國小麥播種面積約占糧食作物的27%，在糧食生產(chǎn)中具有舉足輕重的作用[42]，而其生長發(fā)育易受到病蟲害等生物脅迫與干旱、鹽堿和低溫等非生物脅迫的影響。作為世界上主要的農(nóng)作物，小麥抗逆性研究和抗逆育種成為當(dāng)今研究的重要課題。而脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物生物脅迫和非生物脅迫方面均發(fā)揮一定的作用，迄今為止，人們對其作用機(jī)制研究得不是很透徹，但隨著科技的發(fā)展，人們將會通過深入研究和利用LTP蛋白作用機(jī)制，為充分發(fā)揮其基因功能對改良小麥等糧食作物奠定基礎(chǔ)。