蚊蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑抗性研究進(jìn)展

徐鑫 錢坤

蚊蟲(chóng)由于其特殊的行為、生理結(jié)構(gòu)以及與人類生活關(guān)系緊密而成為傳播人類疾病(瘧疾、絲蟲(chóng)病、登革熱等)的重要媒介，是重點(diǎn)防治的醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)之一。目前化學(xué)防治仍然是蚊蟲(chóng)防治的主要手段，其中擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑是蚊蟲(chóng)防治中使用較多的化學(xué)藥劑，自20世紀(jì)廣泛使用以來(lái)，蚊蟲(chóng)對(duì)其抗性水平逐步提高，抗性問(wèn)題逐漸成為人們關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。本研究主要從蚊蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的抗性現(xiàn)狀、抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和抗性機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 蚊蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑抗性現(xiàn)狀

我國(guó)自20世紀(jì)70年代初開(kāi)發(fā)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑以來(lái)，擬除蟲(chóng)菊酯類藥劑便因其對(duì)人畜、環(huán)境友好、安全的特點(diǎn)被大力推廣使用，然而抗藥性問(wèn)題也隨之出現(xiàn)。據(jù)調(diào)查，至1987年淡色庫(kù)蚊種群對(duì)溴氰菊酯、氯菊酯、胺菊酯和速滅菊酯等抗性區(qū)已占27個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)的50%以上，且其抗性發(fā)展動(dòng)向超過(guò)了有機(jī)氯和有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑［1］。近年來(lái)，在全國(guó)范圍內(nèi)蚊蟲(chóng)對(duì)常用擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的報(bào)道不斷。徐建敏等［2］2014年調(diào)查發(fā)現(xiàn)廣州市荔灣區(qū)的白紋伊蚊對(duì)氯菊酯已產(chǎn)生較強(qiáng)抗性，并且另外兩個(gè)區(qū)成蚊對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類藥劑的抗性也在逐漸產(chǎn)生。此外，眾多學(xué)者在過(guò)去幾年間的采集與調(diào)查發(fā)現(xiàn)北京、河北、河南、江西以及山東多個(gè)城市的蚊蟲(chóng)對(duì)于擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑都產(chǎn)生了不同程度的抗性，且抗性水平正在逐步提高。另外，值得注意的是，李慶鳳［3］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)氯氰菊酯處理過(guò)的淡色庫(kù)蚊的幼蟲(chóng)抗性高于成蟲(chóng)。多項(xiàng)研究證明，蚊蟲(chóng)對(duì)于擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的抗性問(wèn)題已十分嚴(yán)重。

此外，有研究表明，蚊蟲(chóng)也極易對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生交互抗性。調(diào)查表明，對(duì)于一種媒介蚊蟲(chóng)，一旦其由于各種因素對(duì)某一種或某一類擬除蟲(chóng)菊酯類藥劑產(chǎn)生了一定的抗性，其在很大程度上也會(huì)對(duì)同等作用機(jī)制的其余擬除蟲(chóng)菊酯類藥劑產(chǎn)生交互抗性?？芫败幍龋?］研究發(fā)現(xiàn)蚊蟲(chóng)對(duì)氯氰菊酯、溴氰菊酯和三氯殺蟲(chóng)酯這三種常用殺蟲(chóng)劑存在著交互抗性，且利用一種擬除蟲(chóng)菊酯類藥劑選育的蚊蟲(chóng)易對(duì)其余擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性，但不同擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑混合選育，蚊蟲(chóng)抗性發(fā)展則有所不同。同樣地，李向東等［5］研究發(fā)現(xiàn)抗氯氰菊酯品系對(duì)敵敵畏以及殘殺威均可產(chǎn)生低度交互抗性。多項(xiàng)調(diào)查表明，蚊蟲(chóng)一旦對(duì)一種擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生高抗性后，便會(huì)大大影響許多同等作用機(jī)制的擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的實(shí)用價(jià)值，需要合理施用該類藥劑，避免產(chǎn)生交互抗性。

2 蚊蟲(chóng)的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

在室內(nèi)進(jìn)行抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作是目前進(jìn)行抗性治理的主要手段，尤其是一種藥效較好的藥劑進(jìn)入市場(chǎng)之前，對(duì)其進(jìn)行合理的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作，可以有效預(yù)測(cè)其對(duì)于靶標(biāo)害蟲(chóng)抗性發(fā)展的動(dòng)態(tài)情況，降低盲目用藥帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于制定合理、安全的抗性治理方法，具有極為重要的意義。目前，我國(guó)關(guān)于蚊蟲(chóng)抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)道不多，宋鋒林等［6］以淡色庫(kù)蚊的敏感與抗性品系為材料，分別使用溴氰菊酯和ES－生物丙烯菊酯兩種擬除蟲(chóng)菊酯類藥劑對(duì)其進(jìn)行逐代篩選，并采用現(xiàn)實(shí)遺傳的研究方法，計(jì)算抗性篩選后品系的現(xiàn)實(shí)遺傳力情況，并對(duì)這兩種藥劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行室內(nèi)評(píng)估，結(jié)果表明:在實(shí)驗(yàn)室條件下，溴氰菊酯品系抗性發(fā)展速率顯著快于ES－生物丙烯菊酯品系，其抗藥性上升潛力也大于ES－生物丙烯菊酯品系。淡色庫(kù)蚊自然種群對(duì)ES－生物丙烯菊酯不易產(chǎn)生高抗藥性，但對(duì)溴氰菊酯易產(chǎn)生高抗藥性。劉洪霞等［7］經(jīng)過(guò)17代的室內(nèi)選育，發(fā)現(xiàn)白紋伊蚊對(duì)溴氰菊酯的抗性可達(dá)到36.7倍，白紋伊蚊對(duì)溴氰菊酯的抗性 h2為0.1257，抗性風(fēng)險(xiǎn)較大，并且根據(jù)抗性發(fā)展規(guī)律，可以預(yù)估其抗性上升十倍的代數(shù)，從而可以探究溴氰菊酯對(duì)白紋伊蚊的抗性風(fēng)險(xiǎn)，為藥劑的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

3 蚊蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)制研究

3.1 代謝抗性

3.1.1 細(xì)胞色素: P450氧化酶系(P450 s):P450 s氧化酶系是硫醇鹽蛋白的超家族，可參與多種物質(zhì)的代謝解毒過(guò)程，是害蟲(chóng)代謝抗性最主要的機(jī)制之一。P450 s在昆蟲(chóng)中主要是對(duì)昆蟲(chóng)激素(包括保幼激素與蛻皮素)的合成與分解，對(duì)殺蟲(chóng)劑以及植物毒素等化合物的活化和解毒起作用。因此，細(xì)胞色素P450是許多代謝途徑中的重要解毒酶。關(guān)于細(xì)胞色素P450與昆蟲(chóng)抗藥性的關(guān)系，最早發(fā)現(xiàn)的是P450抑制劑sesamax能夠逆轉(zhuǎn)昆蟲(chóng)對(duì)西維因的抗性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明sesamax是P450的抑制劑，隨后體外實(shí)驗(yàn)也予以證實(shí)細(xì)胞色素P450與昆蟲(chóng)對(duì)藥劑西維因產(chǎn)生抗性有關(guān)。以往的眾多研究結(jié)果證實(shí):與P450氧化酶系相關(guān)的抗性害蟲(chóng)常常能夠表現(xiàn)出某種P450的過(guò)量表達(dá)。如異源表達(dá)的 CYP6A1，CYP6A2，CYP6D1等具有對(duì)殺蟲(chóng)劑代謝的活性直接證明了這些P450的過(guò)量表達(dá)在殺蟲(chóng)劑抗性形成中起作用。

在如今已鑒定的昆蟲(chóng) P450家族中，大多認(rèn)為CYP6家族與殺蟲(chóng)劑抗性的產(chǎn)生有著密切的關(guān)系，但是隨著研究的進(jìn)行，CYP4、CYP9和CYP12家族等也漸漸進(jìn)入人們的視野。曹俊等［8］研究發(fā)現(xiàn)兩種增效劑(PBO、TPP)對(duì)嗜人按蚊敏感品系和不同程度的抗性品系都有增效作用，故其猜測(cè)嗜人按蚊對(duì)于溴氰菊酯的抗性機(jī)理可能是解毒酶活力增強(qiáng)引起的，多功能氧化酶可能起著重要作用。LIU等［9］通過(guò)研究證實(shí)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的致倦庫(kù)蚊體內(nèi)CYP6AA7、CYP9J40、CYP9J34 和 CYP9M10 含量在致倦庫(kù)蚊不同生長(zhǎng)階段都呈現(xiàn)顯著表達(dá)，且抗性水平越高的品系，表達(dá)水平也越高。STEVENSON等［10］研究發(fā)現(xiàn)抗性品系蚊蟲(chóng)體內(nèi)存在CYP9JS過(guò)轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象，其中以 CYP9J24、CYP9J26、CYP9J28和CYP9J32與擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑抗性關(guān)系較為密切。KASAI等［11］利用PCR(q RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)到埃及伊蚊體內(nèi)的2個(gè)P450亞型為CYP96M6和 CYP6BB2，且其P450表達(dá)水平和氯菊酯降解速率一一對(duì)應(yīng)，由此得出細(xì)胞色素P450單氧酶(P450 s)在抗性發(fā)育過(guò)程中起著重要作用，且體外代謝研究也表明P450 s與耐藥性有關(guān)聯(lián)。Toé等［12］在西非研究發(fā)現(xiàn)抗擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑品系的蚊蟲(chóng)體內(nèi)的 CYP4G16、CYP6P1、CYP9J5、CYP6Z3、CYP9M1以及 CYP6P4均呈現(xiàn)顯著表達(dá)。JEFFREY等［13］研究表明CYP9M10在蚊蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯耐藥性中一直被過(guò)度表達(dá)。以上研究可以充分證明P450 s基因的點(diǎn)突變、過(guò)轉(zhuǎn)錄和高表達(dá)等現(xiàn)象是造成蚊蟲(chóng)P450 s解毒代謝增強(qiáng)的重要機(jī)制。

3.1.2 非專一性酯酶(ESTs): ESTs在蚊蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的抗性中發(fā)揮重要作用。編碼 ESTs的基因點(diǎn)突變、擴(kuò)增和表達(dá)量增加是蚊蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的重要分子機(jī)制，其中羧酸酯酶起著重要作用。羧酸酯酶是自然界多數(shù)昆蟲(chóng)體內(nèi)含有的一類重要解毒酶系，其主要是利用水解蛋白和結(jié)合蛋白這兩種主要方式對(duì)藥劑進(jìn)行解讀，而隨著代謝解毒過(guò)程的進(jìn)行，抗性也往往隨著羧酸酯酶活力的升高而產(chǎn)生，羧酸酯酶活力測(cè)定在如今應(yīng)用較多的擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的代謝中發(fā)揮著尤為重要的作用［14］。國(guó)內(nèi)已有部分研究表明蚊蟲(chóng)抗性機(jī)制與羧酸酯酶有一定聯(lián)系，徐建敏等［2］研究發(fā)現(xiàn)白紋伊蚊對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑的代謝速率與其體內(nèi)羧酸酯酶的活性高低存在一定的聯(lián)系，吳能簡(jiǎn)等［15］研究發(fā)現(xiàn)隨著羧酸酯酶活性的上升，白紋伊蚊對(duì)于氯菊酯的抗性水平也有一定的提高。

國(guó)外也有相應(yīng)研究，F(xiàn)AUCON等［16］研究表明，泰國(guó)抗擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑品系的埃及伊蚊體內(nèi)的3個(gè)羧酸酯酶(CCEae3a、CCEae4a和CCEae6a)均發(fā)生了變異。POUPARDIN等［17］在泰國(guó)研究發(fā)現(xiàn):在埃及伊蚊各種群中擴(kuò)增水平較高的擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑抗性的那空沙旺(NS)種群中，抗性品系CCEae3a比敏感品系表達(dá)上調(diào)了60多倍，此外，CCEae6a表達(dá)也存在上調(diào)的現(xiàn)象，CCEae3a的測(cè)序和模擬結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示:NS種群抗性增加與幾種氨基酸的多態(tài)性也有一定關(guān)系。這些研究進(jìn)一步證明由于編碼基因擴(kuò)增造成的羧酸酯酶表達(dá)上調(diào)，是蚊蟲(chóng)解毒代謝增強(qiáng)的重要機(jī)制。

3.1.3 谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶(GSTs): GSTs是一種多功能解毒酶系，可參與多種有毒物質(zhì)的解毒代謝過(guò)程。目前，蚊蟲(chóng) GSTs分為7個(gè)亞族，其中 Delta和Epsilon是蚊蟲(chóng)特異性亞族，已鑒定的蚊蟲(chóng)抗藥性相關(guān)基因主要分屬于這2個(gè)亞族［18］。GSTs可以參與蚊蟲(chóng)對(duì)于擬除蟲(chóng)菊酯類藥劑的抗性產(chǎn)生過(guò)程，在非洲中、西部，DDT和氯菊酯交叉抗性的致死按蚊中也發(fā)現(xiàn)GSTE2高水平表達(dá)，并通過(guò)全基因轉(zhuǎn)錄組的功能分析、結(jié)構(gòu)種群遺傳學(xué)的研究，證實(shí)其高表達(dá)是由GSTE2的單氨基酸(L119F)改變聯(lián)合轉(zhuǎn)錄增加造成［19］。此外，據(jù) JONES 等［20］研究表明，布基納法索城區(qū)內(nèi)對(duì) DDT產(chǎn)生抗性的阿拉伯按蚊(An.Arabiensis)體內(nèi)的GSTD3表達(dá)上調(diào)，通過(guò)這一研究可以證明GSTs基因表達(dá)上調(diào)是導(dǎo)致GSTs解毒代謝增強(qiáng)的主要機(jī)制。

3.2 靶標(biāo)抗性 鈉離子通道是幾種神經(jīng)毒劑的分子靶標(biāo)，這些神經(jīng)毒劑具有高度的親和性與選擇性，可以與鈉離子通道專一的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而改變鈉離子通道的功能。神經(jīng)毒理學(xué)研究表明:擬除蟲(chóng)菊酯引起神經(jīng)興奮性毒性是因?yàn)檠舆t神經(jīng)細(xì)胞鈉離子通道的關(guān)閉，也就是擬除蟲(chóng)菊酯占領(lǐng)鈉離子通道結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅵ的S6片段(位于鈉離子通道內(nèi)外兩側(cè)之間的疏水性區(qū)域)，從而延遲鈉離子通道的失活過(guò)程，產(chǎn)生持久的活化，導(dǎo)致重復(fù)后放并阻斷了神經(jīng)傳導(dǎo)。NATAHASHI等［21］研究表明擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑主要作用于蚊蟲(chóng)的鈉離子通道，引起鈉離子通道內(nèi)氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變異，從而延緩了鈉離子通道的關(guān)閉，使鈉離子不斷向內(nèi)流失，進(jìn)而引起蚊蟲(chóng)神經(jīng)沖動(dòng)的重復(fù)后放，與此同時(shí)還阻斷了突觸傳遞的進(jìn)行。

劉宏美等［22］利用PCR以及AS-PCR等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)淡色庫(kù)蚊kdr基因突變與溴氰菊酯抗藥性發(fā)生存在一定關(guān)系。SINGH 等［23］利用 PCR(PIRA-PCR)技術(shù)，對(duì)印度地區(qū)53個(gè)淺色按蚊體內(nèi)的SC靶標(biāo)(L1014的ⅡS6結(jié)構(gòu)域)進(jìn)行了DNA測(cè)序，結(jié)果顯示在亮氨酸1014的第3密碼子上，明顯存在著2個(gè)非同義突變:A＞C與A＞T，兩種突變直接導(dǎo)致亮氨酸(TTA)被替換成苯丙氨酸(TTT或TTC)，三種等位基因TTA、TTT和TTC的發(fā)生頻率分別為0.14、0.19和0.67，由此結(jié)果可以求得編碼苯丙氨酸等位基因發(fā)生頻率為0.86。此外，淺色按蚊亮氨酸kdr基因座中的A＞C突變比A＞T突變具有更加重要的意義，由此可以直接證明蚊蟲(chóng)靶標(biāo)抗性的產(chǎn)生與靶標(biāo)SC上的點(diǎn)突變引起的關(guān)鍵部位氨基酸交換存在密切關(guān)系。王學(xué)軍等［24］研究發(fā)現(xiàn)野外種群淡色庫(kù)蚊對(duì)溴氰菊酯抗性水平與kdr等位基因頻率存在顯著的相關(guān)性，然而高效氯氰菊酯、氯氰菊酯抗性水平與kdr等位基因頻率無(wú)顯著相關(guān)性，存在一定差異。

3.3 表皮抗性 表皮抗性的發(fā)生機(jī)制主要是由于蚊蟲(chóng)自身表皮的影響，導(dǎo)致藥劑穿透表皮效率降低，延長(zhǎng)藥劑作用到靶標(biāo)部位的時(shí)間，從而降低了藥劑在蚊蟲(chóng)體內(nèi)的有效濃度，時(shí)間一長(zhǎng)便引起了蚊蟲(chóng)的抗性。表皮抗性與蚊蟲(chóng)抗性代謝存在一定的正相關(guān)性，主要是由于蚊蟲(chóng)表皮的增厚可以使其容納下藥劑中更多的酯類成分，對(duì)于藥劑的穿透起到了一定的限制作用，對(duì)于其提升抗藥性起到了一定的促進(jìn)作用。近年來(lái)，F(xiàn)ANG等［25］研究發(fā)現(xiàn)在淡色庫(kù)蚊的溴氰菊酯抗性品系和敏感品系中，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)了14種表皮蛋白(ICPs)，接著通過(guò) qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無(wú)論是實(shí)驗(yàn)室種群還是野外種群，抗性品系的CpCPLCG5基因的表達(dá)水平均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于敏感品系，但是其余13種表皮蛋白均表現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象。另外，用小干擾RNA(siRNA)敲除 CpCPLCG5基因時(shí)發(fā)現(xiàn)抗性品系的敏感性明顯增強(qiáng)，然而其他13種表皮蛋白卻又表達(dá)出上調(diào)的現(xiàn)象，從而可以表明淡色庫(kù)蚊表皮抗性的產(chǎn)生與其表皮蛋白的表達(dá)上調(diào)存在明顯關(guān)系。另外，李慶鳳［3］對(duì)淡色庫(kù)蚊 SS品系和 CR品系的幼蟲(chóng)和成蚊的抗性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明幼蟲(chóng)的抗性要明顯高于成蟲(chóng)，探究發(fā)生原因可能是由于幼蟲(chóng)與成蟲(chóng)體內(nèi)代謝水平和對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)程度存在一定差異，幼蟲(chóng)由于長(zhǎng)期生活在水中，隨著通過(guò)表皮滲透進(jìn)的藥劑有效成分的增多，幼蟲(chóng)對(duì)藥劑也逐漸適應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生了較高水平的抗性，而成蟲(chóng)由于接觸部位以及表皮厚度不如幼蟲(chóng)等因素，表現(xiàn)出來(lái)的抗性水平可能就不如幼蟲(chóng)。

4 討論

由于早期人類大量使用殺蟲(chóng)劑的原因，如今蚊蟲(chóng)抗性問(wèn)題已成為一個(gè)世界性難題，所以對(duì)蚊蟲(chóng)進(jìn)行室內(nèi)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作和抗性機(jī)制的研究顯得格外重要。國(guó)外學(xué)者HARDSTONE等［26］研究表明蚊蟲(chóng)抗性產(chǎn)生不僅僅是單一作用，還可能存在不同抗性機(jī)制間的相互作用，且LIU等［27］研究表明殺蟲(chóng)劑的易感性變化水平不應(yīng)基于單一的評(píng)估方法，由此可見(jiàn)蚊蟲(chóng)抗藥性問(wèn)題研究較為復(fù)雜。但是隨著人們對(duì)于分子生物學(xué)研究的不斷深入，對(duì)于蚊蟲(chóng)抗性的產(chǎn)生，發(fā)展過(guò)程也開(kāi)始從基因?qū)用孢M(jìn)行深入探索，對(duì)蚊蟲(chóng)抗性品系基因的分離、克隆以及表達(dá)差異等方面的鑒定，可以很好的從分子角度研究蚊蟲(chóng)抗性產(chǎn)生機(jī)制。然而目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于蚊蟲(chóng)抗性遺傳方式的系統(tǒng)性研究報(bào)道較少，因此開(kāi)展相應(yīng)藥劑抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作以及抗性機(jī)制的研究工作對(duì)于開(kāi)展抗性治理具有重要的指導(dǎo)意義。

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