尿路感染檢測方法研究進展

雷 佳，劉世巍，鄧秀敏

中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院腎內科(北京 100102)

主題詞 泌尿道感染 生物學鑒定法 質譜法 藥物耐受性 聚合酶鏈反應

尿路感染是最常見的社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性感染之一，超過50%的女性一生中至少經歷過1次尿路感染[1]，而曾患UTI的女性患者中高達25%會在隨后的日常生活中出現復發(fā)[2]。在美國，尿路感染每年造成的花費高達35億美元[3]，占相當大額度的醫(yī)療保健支出，加之其高發(fā)病率及復發(fā)率，為公共衛(wèi)生系統帶來了沉重負擔。

目前，診斷和治療尿路感染的主要手段仍依賴于尿培養(yǎng)的結果，但此方法從鑒定病原體到藥敏試驗(Antimicrobial susceptibility test，AST)總共至少需要42～78h[4]。臨床工作者，往往平均3d才能獲得致病菌及其藥敏結果。因此，經驗性的使用廣譜抗生素使得病原菌耐藥甚至多耐藥日趨嚴重。耐藥和耐多藥的病原體的出現更是造成全球范圍內的醫(yī)療保健威脅[5]，因此，快速鑒定病原體及其抗菌藥物敏感性的技術成為尿路感染患者精確診斷、優(yōu)化治療以及改善抗生素濫用的迫切需求。近年來，即時檢驗技術、分子生物學技術等新型檢測技術的發(fā)展及應用將為尿路感染的診治帶來福音?，F將上述檢測手段綜述如下。

1 菌尿即時篩選技術

即時檢驗(Point of care testing，POCT)是當今臨床檢驗發(fā)展的趨勢之一。POCT不單純以提高檢測精度為目標，而且對于推動個體化化醫(yī)療和疾病篩查等具有重要意義[6]。對于尿液標本的快速篩選不僅可以簡化微生物室的試驗流程，也可以減低成本，從而達到提高檢驗效率的目的。

1.1 側流免疫層析 側流免疫層析(Lateral flow chromatographic assay ，LFCA))是一種將免疫標記技術與色譜層析技術等相結合的固相膜免疫分析技術，該技術需通過標記物獲取信號數據以分析結果，具有成本低廉、 操作簡便、檢測結果敏感性高和快速等優(yōu)點[7]。近年來，高靈敏度的光信號、磁信號、電化學信號探針的應用使得LFCA的靈敏度和精準度取得了長足進步，尤其是納米粒子應用和發(fā)展，其被看作是LFCA的示蹤劑[8]。國外文獻報道早在2015年，新型的橫向流動分析(RapidBac)技術已應用于獸醫(yī)行業(yè)，目前正在人體研究中進行評估，未來將應用于快速的菌尿檢測[9]。RapidBac技術[9]對966份人體尿液標本進行了鑒定，發(fā)現尿液標本細菌量≥103cfu/ml的靈敏度為86%，特異性為94%；革藍氏陰性菌細菌量≥104cfu/ml達到96%。這些數據對于LFCA未來在人體尿液檢測帶來了希望，下一步仍需通過多中心前瞻性研究鑒定此方法的精準度。

1.2 流式細胞術 流式細胞術(Flow cytometry，FCM)是利用基于光束對細胞或微粒進行參數定量分析和篩選的快速檢測技術，具有快速、靈敏、精確等突出優(yōu)點。在國外，FCM已廣泛應用于細菌常規(guī)檢查[10]，而我國起步較晚。常規(guī)細菌計數方法主要是國家標準推薦的平板法[11]和通用的顯微技術，FCM可以同時克服傳統方法耗時長和誤差大的缺點，快速得到細菌總數，若檢測的是一定體積樣品中的菌數，即得知菌濃度[12]。通過流式細胞術初步篩選尿液樣本可以減少進一步分析的樣本數量來改進臨床實驗室工作流程，然而，流式細胞術僅僅是篩查菌尿，它不能夠提供病原體鑒定和藥敏試驗來進行確定性診斷[13-15]。正在進一步嘗試將一些形態(tài)信息納入光散射技術中[16]，例如用十二烷基硫酸鈉區(qū)分革藍氏陽性菌和革藍氏陰性菌的差異以及區(qū)分不同桿菌的光散射圖案[17]，但是這些技術是仍是實驗性的，有待于進一步研究應用于尿液檢測。

2 分子生物學技術

分子生物學技術已使病原微生物的檢測達到了DNA、RNA水平，其在很大程度上可以提高檢驗范圍與精度。已有研究證實許多病原微生物對特定抗菌藥物耐藥性具有一定遺傳基礎[18]，這一理論可以通過靶向病原體特異性分子標記來識別病原體。MALDI-TOF質譜、熒光原位雜交和聚合酶鏈反應、基因芯片技術早已應用于一些病原微生物感染的診斷。由于人類尿液標本pH值、電解質濃度、細胞組成等差異的存在，導致利用上述技術檢測尿液標本之前需要分離細菌細胞[19-20]。目前上述方法已在實驗室中進行研究，未來利用該方法直接檢測尿液，從而達到診斷尿路感染的目的將成為可能，并且該法時效性和精準性或優(yōu)于現有尿培養(yǎng)方法[20]。

2.1 多重聚合酶鏈反應 聚合酶鏈反應(Plolymerase chainreaction，PCR)作為體外核酸擴增技術其靈敏度和特異性使得能夠檢測到罕見的靶標。國外有研究提出多重PCR通過同時加入多對引物，擴增不同細菌特異性片段來同時快速檢測各種細菌，可直接對液體血培養(yǎng)物進行提取檢測，更適合一般臨床實驗室對病原菌的鑒定及初篩[21]。部分公司正在研究Septi Fast(實時PCR)技術用于直接檢測尿路感染患者尿液標本[22]。為了探索該平臺對UTI診斷的可能性，利用Septi Fast直接檢測了疑似尿路感染患者的82份尿液標本，結果發(fā)現靈敏度和特異性分別為82%和60%[22]。由于臨床中患者對尿液標本的收集方式使得尿液標本存在污染的可能性，造成PCR結果易出現假陽性可能，因此在利用PCR檢測尿液標本之前要對細菌進行量化。實時定量PCR法可準確定量標本中特殊核酸的拷貝數的特點來測量細菌生長量的方法，以此來判斷藥敏結果，這給臨床微生物藥敏試驗提供了新的思路。

2.2 熒光原位雜交 熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，FISH )是一項利用探針直接在染色體、細胞或組織水平定位靶序列的分子生態(tài)學技術，能夠對復雜的難培養(yǎng)和未培養(yǎng)的微生物進行菌種鑒定、數量及細胞形態(tài)等進行分析。hemoFISH和QuickFISH已被FDA批準用于鑒定血液中的病原微生物，hemoFISH使用DNA探針，而QuickFISH分析是基于肽核酸(PNA)探針，Quickfish可在20min內檢測標本，靈敏度和特異性>96%[23-25]。Quickfish可直接快速檢測尿路感染患者尿液中高濃度的細菌，但現有數據表明FISH是受限于無法納入藥敏分析[26]，因此，未來用于尿路感染的診斷仍存在挑戰(zhàn)。

2.3 MALDI-TOF MS質譜技術 MALDI-TOF MS以蛋白質為靶標分子已應用于大腸埃希氏菌的檢測[27]。Ferreira等[28]選取尿液中細菌大于105cfu/ml標本進行研究，結果顯示尿標本經過差速離心法處理后，可將91.8%的菌株鑒定到種。Lotz等[29]的研究顯示，對菌株進行相應的標本前處理之后，MALDI-TOF MS對于分枝桿菌鑒定的準確率可達97%；其中67%可鑒定到種的水平，30%可鑒定到復合體的水平。由于大腸埃希菌和志賀菌的蛋白質譜圖很相似，兩者無法通過MALDI-TOF MS區(qū)分；其次，儀器的初始購買價格很高，標本前處理過于復雜，雖然MALDI-TOF MS已大型臨床實驗室中使用，但利用質譜診斷早期尿路感染的價值并不高[29]。

2.4 微流控芯片 “微流控芯片”這一概念是由Whitesides[30]研究團隊首次提出的。近年來，其逐漸發(fā)展成熟，憑借分析快速、成本低、消耗低、重現性好、通量高、多功能、集成好并可以在接近生理環(huán)境下運行等特點，成為近年來熱點前沿分析技術之一[31]。文小霞等[32]人選用4種尿路感染常見病原菌作為模擬測試對象，通過實驗研究發(fā)現這種芯片方法在15h內可完成細菌鑒定，檢測限可達101cfu/ml。齊明月等[33]人以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌為模擬測試對象進行分析，結果表明，芯片方法可以在18h內實現對3種細菌的同時鑒定及6種抗生素敏感性測試，與傳統細菌鑒定方法和抗生素敏感性測試結果一致性分別為94.1%和93.9%。隨著納米技術的發(fā)展，利用納米熒光標記探針可有效克服芯片檢測中面臨的低靈敏度和低選擇性的兩重限制，實現病原微生物多位點和多對象的鑒定。

3 總結與展望

綜上所述，尿路感染的高發(fā)病率、高復發(fā)率及其造成的龐大醫(yī)療支出等因素促使尿路致病菌的快速、實時、精準檢驗成為目前臨床診治的關鍵；其次，改善和遏制病原微生物耐藥和多耐藥情況也依賴于即時檢驗手段的發(fā)展。菌尿即時篩選技術，如側流免疫層析、流式細胞術的應用減少了微生物實驗室的檢驗流程，節(jié)約了實驗成本，更重要的是縮短了檢驗時間，使尿路感染檢測“實時”化發(fā)展；分子生物學技術的發(fā)展，使得檢驗水平的特異性、靈敏性和自動化有所提高，其與納米技術的結合更使檢驗范圍擴展化，使尿路感染的檢測趨向于“精準”化。然而由于各地醫(yī)療環(huán)境的限制，我國目前仍以傳統的檢測手段為主，上述新興技術仍局限于實驗室水平；其次，由于檢驗設備費用昂貴，部分技術標本檢測前的處理步驟復雜，二級、一級甚至社區(qū)醫(yī)院想要實現新興技術的應用仍面臨挑戰(zhàn)。未來一旦，這些問題能夠解決，開發(fā)和應用上述快速，精準的尿路感染檢測手段將有助于臨床診斷和治療。早期精準的治療過程不僅有利于患者的預后，而且有利于改善臨床中抗生素濫用和管理。尿路感染的精準治療依賴于實驗室診斷，而精準的診斷離不開上述檢測手段的發(fā)展，在及時的時間應用正確的藥物是尿路感染患者治療的關鍵。