線粒體近日節(jié)律的研究進(jìn)展*

應(yīng)俊杰 李世平 屈藝 母得志

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒科/出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點(diǎn)實驗室，四川 成都 610041)

隨著地球的自轉(zhuǎn)和公轉(zhuǎn)，我們賴以生存的環(huán)境，也呈現(xiàn)出節(jié)律性地改變。而對于地球上生存的大多數(shù)生物有機(jī)體而言，適應(yīng)自然環(huán)境的改變是唯一的生存之道，于是從分子、細(xì)胞到機(jī)體、群體各個層次上都形成了明顯的時間周期現(xiàn)象，即生物節(jié)律。生物節(jié)律又分為近日節(jié)律、超日節(jié)律和亞日節(jié)律，這其中最受關(guān)注并廣泛研究的是近日節(jié)律。近日節(jié)律系統(tǒng)調(diào)控整個有機(jī)體的節(jié)律活動，其根本在于生物體內(nèi)有大量鐘控基因，這些基因又會影響多個信號通路的變化，最終影響生理功能[1]。現(xiàn)今已經(jīng)獲得廣泛承認(rèn)和深入研究的節(jié)律基因包括Clock、Bmal1、Per以及Cry等[2, 3, 4]。通過研究這些節(jié)律基因的分子機(jī)制，形成了經(jīng)典的負(fù)反饋環(huán)路調(diào)節(jié)節(jié)律模型[5, 6]，即：光照階段動物視交叉上核(Suprachiasmatic nucleus，SCN)處Bmal1表達(dá)升高，其蛋白產(chǎn)物與Clock蛋白相互結(jié)合形成異物二聚體，并從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核[7]，與節(jié)律基因Per和Cry的表達(dá)序列上游e-box元件結(jié)合，起始它們的轉(zhuǎn)錄和翻譯[8]。Per和Cry蛋白又會形成異物二聚體，并抑制Clock-Bmal1異物二聚體活性，使Per和Cry自身基因及蛋白表達(dá)下降，解除了對Clock-Bmal1異物二聚體的抑制作用，如此反復(fù)循環(huán)[9]。

越來越多的研究闡述了新陳代謝和近日節(jié)律之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系。一方面，近日節(jié)律在各個代謝途徑中扮演了重要的角色；另一方面，一些代謝產(chǎn)物和代謝過程也影響著生物鐘功能。在大量的描述節(jié)律和新陳代謝的綜述中，其中一些著重闡明近日節(jié)律作用的分子機(jī)制[10-13]，另一些則側(cè)重研究了節(jié)律與代謝的相互影響[14-18]，然而，很少有深入到線粒體層面的研究。線粒體是真核細(xì)胞的主要代謝中心，參與了有氧呼吸、脂類合成、鈣平衡等極其重要的生命過程，因此我們可以推測，近日節(jié)律與新陳代謝相互影響的過程中，線粒體極有可能在其中發(fā)揮了重要的功能。本文搜集了目前在線粒體近日節(jié)律方面的研究，通過線粒體組學(xué)研究及潛在的功能探究，討論線粒體在哺乳動物體內(nèi)的節(jié)律功能以及線粒體本身具有的節(jié)律性。

1 線粒體的自發(fā)節(jié)律

線粒體的祖先——原線粒體是一種革蘭陰性菌，在15億年前被早期的真核生物吞噬到體內(nèi)并保留，最終演化為真核細(xì)胞的一種細(xì)胞器[19]。這一理論被稱為內(nèi)共生起源學(xué)說，認(rèn)為線粒體曾經(jīng)是獨(dú)立的自由生命體，擁有完整的生存和繁殖機(jī)制。然而，在整個進(jìn)化過程中，它們的一些功能已經(jīng)丟失或轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，這其中可能包括一些節(jié)律與代謝相互調(diào)控的功能，那么線粒體在真核細(xì)胞中行使節(jié)律功能的同時，自身是否還保留了自發(fā)節(jié)律呢？目前關(guān)于哺乳動物體內(nèi)的線粒體自發(fā)節(jié)律研究尚待深入，但有人在對酵母菌的研究中發(fā)現(xiàn)，“酵母代謝循環(huán)”具備近日節(jié)律的某些特征，雖然周期往往只有幾個小時[20-21]，但是進(jìn)一步的檢測發(fā)現(xiàn)其線粒體氧化活性也是具有節(jié)律振蕩的[20]。酵母菌是最簡單的具有線粒體的真核細(xì)胞，但由于酵母菌和哺乳動物的線粒體具有高度的保守性，所以科學(xué)家推測線粒體可能具有自發(fā)節(jié)律，但目前的證據(jù)略顯不足，有待研究的進(jìn)一步深入。

2 線粒體形態(tài)學(xué)的近日節(jié)律

線粒體形態(tài)學(xué)，主要是研究線粒體由于分裂、融合以及自噬而引起的形態(tài)和大小的改變，進(jìn)而直接影響到線粒體功能。有研究發(fā)現(xiàn)，融合的線粒體比分裂的線粒體對底物的利用率更高，其呼吸作用的效率也更高[22]。

早在1981年，電子顯微鏡問世后，Uchiyama Y等[23]就用電子顯微鏡觀察了大鼠肝臟中的線粒體，發(fā)現(xiàn)其形狀和體積在光暗周期中有著節(jié)律性的變化。而最近的一項研究表明，在小鼠的肝臟中，很多基因都與線粒體形態(tài)具有相關(guān)性，并且這些基因往往依賴于BMAL1表現(xiàn)出節(jié)律性[22]。由此可以推測，BMAL1在線粒體形態(tài)改變的過程中，可能處于一個較為核心的地位。于是，為了探究BMAL1在線粒體形態(tài)中的功能作用，研究者設(shè)計了肝臟特異性敲除Bmal1基因的小鼠并發(fā)現(xiàn)，相比于正常小鼠，在敲除小鼠的肝臟中，線粒體在形態(tài)上表現(xiàn)的更大更圓，并且線粒體的形態(tài)在一天當(dāng)中不再發(fā)生改變[24]。此外，進(jìn)一步的研究表明，在肝臟特異性敲除Bmal1基因的小鼠體內(nèi)，線粒體更容易受到氧化應(yīng)激相關(guān)的損傷[24]，由此可見，BMAL1的缺失使線粒體在功能上也發(fā)生了異常。

不僅是在肝臟中，在別的組織和器官中，甚至是在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，也同樣能觀察到線粒體形態(tài)的節(jié)律性改變。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠骨骼肌和心臟中，線粒體的形態(tài)也會受到節(jié)律基因的調(diào)控，并且會影響到這些器官功能[25,26]。另有報道發(fā)現(xiàn)在體外環(huán)境下，巨噬細(xì)胞中的線粒體形態(tài)同樣受到節(jié)律基因調(diào)控，并表現(xiàn)出節(jié)律性的形態(tài)改變[27]。既然線粒體形態(tài)上的節(jié)律變化與節(jié)律基因的調(diào)控相關(guān)，那么，是否和線粒體自身的基因組有關(guān)系呢？然而，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體基因組的總拷貝數(shù)在一天中是恒定的，并且不會受到節(jié)律基因的調(diào)控[24,26,28,29]。

總之，這些研究揭示了線粒體形態(tài)變化的節(jié)律性，并初步探究了其中的功能影響，對今后研究線粒體節(jié)律指明了重要的研究方向，對研究線粒體節(jié)律功能具有重要的意義。

3 線粒體組學(xué)的近日節(jié)律研究

3.1 線粒體蛋白質(zhì)組的近日節(jié)律

線粒體蛋白質(zhì)組包括了幾百種不同的蛋白質(zhì)[30]，其中大部分的蛋白是由核內(nèi)基因組編碼的，通過蛋白通道運(yùn)輸?shù)骄€粒體中，只有13種蛋白是在線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的[31]。通過對整個肝臟的蛋白組學(xué)進(jìn)行研究，研究者發(fā)現(xiàn)，線粒體中的總蛋白質(zhì)的豐度在一天中是隨時間變化的[32,33]。近年來，越來越多的研究者眼于單線粒體蛋白組學(xué)研究，同樣發(fā)現(xiàn)了這樣的變化[34]。事實上，精確到各種不同的蛋白，在線粒體中，超過三分之一的蛋白在一天中都有豐度的變化[34]，并且它們中的絕大多數(shù)達(dá)到峰值的時間都是在早期光照階段。對線粒體蛋白質(zhì)組的功能注釋顯示，線粒體主要的代謝和氧化功能相關(guān)蛋白表現(xiàn)出晝夜節(jié)律振蕩[34]。另外，調(diào)控線粒體碳水化合物代謝的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(PDC)的幾個組份也是在早期光照階段開始積累的。而控制脂肪酸進(jìn)入線粒體基質(zhì)的限速酶-肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1的峰值出現(xiàn)在晚期黑暗階段和早期光照階段之間[34]。

眾所周知，蛋白是由基因轉(zhuǎn)錄翻譯而來，那么，這些線粒體蛋白的變化是在轉(zhuǎn)錄水平上就已經(jīng)發(fā)生了，還是在翻譯過程中產(chǎn)生的呢？進(jìn)一步的研究通過檢測鐘基因敲除的小鼠中的線粒體蛋白發(fā)現(xiàn)，幾個核編碼的線粒體蛋白在轉(zhuǎn)錄水平就已經(jīng)發(fā)生了改變[35,36]。通過ChIP實驗也證明了BMAL1結(jié)合在這些線粒體蛋白的啟動子上，這說明BMAL1作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控了多個線粒體蛋白的轉(zhuǎn)錄[37,38]。但我們觀察到的線粒體蛋白質(zhì)具有日常變化也可能同時發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的機(jī)制，比如蛋白翻譯的節(jié)律性、蛋白的導(dǎo)入或降解的節(jié)律性。當(dāng)然，這方面的研究還只是理論推測，相信在未來的研究中會闡明這其中各種不同的分子機(jī)制。

3.2 線粒體蛋白翻譯后修飾的節(jié)律性

生物鐘是由一個復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的，它整合了一系列維持生物體內(nèi)平衡的調(diào)節(jié)信號。鐘蛋白的翻譯后修飾功能在其中發(fā)揮著重要的作用，并被認(rèn)為可以將生理信號轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的變化，進(jìn)而調(diào)控了生物體的近日節(jié)律。蛋白的翻譯后修飾調(diào)控著蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和活性，常見的幾種方式包括磷酸化、乙?；头核鼗?。目前在線粒體中研究較為清楚的是關(guān)于線粒體蛋白乙?；墓?jié)律性。Clock基因是晝夜節(jié)律起步基因的核心成分之一，它具有組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(HAT)的活性。所以Clock自然也成為了研究線粒體蛋白乙?；淖钪匾那腥朦c(diǎn)。2013的一項研究通過定量質(zhì)譜檢測了野生型和Clock缺陷型小鼠的肝臟,發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中線粒體的蛋白乙?；癄顟B(tài)在一天中不同的時間都有所改變。此外，許多代謝途徑中涉及的線粒體蛋白都受到了由Clock調(diào)控的乙?；闹匾绊?，包括三羧酸循環(huán)以及谷胱甘肽代謝的中的蛋白，都依賴于CLOCK乙?；稽c(diǎn)[39]。這提示我們線粒體蛋白乙?；赡芎凸?jié)律代謝組學(xué)也有著重要的關(guān)聯(lián)，但其中具體的作用還缺乏有力的證據(jù)。除了Clock調(diào)控的乙?；饔?，Peek等[40]還發(fā)現(xiàn)，在野生型和Bmal1-缺陷型的小鼠中，許多線粒體蛋白的乙酰化狀態(tài)也有所不同。例如，脂肪酸代謝酶的乙?；c它們的活性有關(guān)，同時也依賴于BMAL1。此外，隨著線粒體呼吸作用的變化，呼吸復(fù)合物I的乙?；揭渤尸F(xiàn)出節(jié)律性的改變[41]。這些證據(jù)都表明，許多線粒體蛋白的乙?；季哂忻黠@的節(jié)律性，并在調(diào)控線粒體功能中發(fā)揮了重要的作用。

其他的線粒體蛋白的轉(zhuǎn)錄后修飾，如磷酸化，是否同樣具有節(jié)律性，也是非常值得深究的問題，雖然現(xiàn)在的研究還處于空白，但相信會有研究者們確定并進(jìn)一步剖析其在調(diào)控線粒體節(jié)律性中的功能和作用機(jī)制。

3.3 線粒體的脂質(zhì)的節(jié)律

脂質(zhì)是生物膜的主要組成部分，同時也是線粒體膜的主要成分，決定了線粒體膜的物理性質(zhì)，以及它們的蛋白質(zhì)含量。此外, 脂質(zhì)還是線粒體呼吸作用的主要能量來源，甚至有一些脂質(zhì)是在線粒體中合成的[42]。最近的一項研究對從小鼠肝臟分離的線粒體應(yīng)用高通量的脂質(zhì)性分析，發(fā)現(xiàn)線粒體中大約三分之一的脂質(zhì)表現(xiàn)出具有節(jié)律性變化，并且其中的絕大多數(shù)都具有近日節(jié)律特征[43]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些脂質(zhì)節(jié)律變化的周期和相位都受到喂養(yǎng)方式(夜間喂食和自由進(jìn)食比較)及節(jié)律基因(per1/2基因敲除鼠和野生型小鼠對比)的影響。在自由進(jìn)食的小鼠中，它們線粒體的脂質(zhì)含量高峰出現(xiàn)在光照周期向黑暗周期轉(zhuǎn)變的過程中，而只在黑暗周期喂食的小鼠，檢測到完全相反的結(jié)果。另一方面，在PER1和PER2缺陷型的小鼠中，線粒體中的脂質(zhì)豐度出現(xiàn)多個峰值，不再表現(xiàn)出節(jié)律性，這說明鐘蛋白PER1和PER2在調(diào)控線粒體脂質(zhì)中扮演了重要的角色[43]。另一方面，正如前面部分提到的，線粒體脂肪酸的構(gòu)成以及它們的代謝也都是依賴于BMAL1完成的[40]。這些都表明了多個節(jié)律基因都可能影響了線粒體脂質(zhì)變化情況，但其具體機(jī)制以及與線粒體蛋白質(zhì)組的相關(guān)性還需要進(jìn)一步的研究。

4 總結(jié)與展望

本文從線粒體自身節(jié)律，線粒體形態(tài)學(xué)和組學(xué)幾個方面討論了線粒體近日節(jié)律的基本調(diào)節(jié)機(jī)制。就目前的研究現(xiàn)狀而言，這幾個方面的研究都有待深入，并不能夠明確地揭示線粒體與近日節(jié)律的調(diào)控機(jī)制；同時，它們之間是否具有一定的相關(guān)性，或是一個更為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，值得進(jìn)一步探索。相信隨著人們對近日節(jié)律的研究越來越關(guān)注，以及對線粒體的研究越來越深入，必定會發(fā)現(xiàn)越來越多的證據(jù)揭示它們之間的調(diào)控關(guān)系以及線粒體節(jié)律在整個代謝節(jié)律中扮演的重要角色。

1 Pilorz V, Helfrich-F?rster C, Oster H. The role of the circadian clock system in physiology[J]. Pflugers Arch, 2018, 470(2): 227-239.

2 Narasimamurthy R, Virshup DM. Molecular mechanisms regulating temperature compensation of the circadian clock[J]. Front Neurol, 2017, 8: 161.

3 Williams C T, Radonich M, Barnes BM, et al. Seasonal loss and resumption of circadian rhythms in hibernating arctic ground squirrels[J]. J Comp Physiol B, 2017, 187(5-6): 693-703.

4 Hayasaka N, Hirano A, Miyoshi Y, et al. Salt-inducible kinase 3 regulates the mammalian circadian clock by destabilizing PER2 protein[J]. Elife, 2017, 6. pil:e24779.

5 Vollmers, C, Schmitz RJ, Nathanson J, et al. Circadian oscillations of protein-coding and regulatory RNAs in a highly dynamic mammalian liver epigenome[J]. Cell Metab, 2012, 16(6): 833-845.

6 Abraham U, Schlichting JK, Kramer A,et al. Quantitative analysis of circadian single cell oscillations in response to temperature[J]. PLoS One, 2018, 13(1):e0190004.

7 Trott AJ, Menet JS. Regulation of circadian clock transcriptional output by CLOCK:BMAL1[J]. PLoS Genet, 2018, 14(1): e1007156.

8 Aryal RP, Kwak PB, Tamayo AG,et al. Macromolecular assemblies of the mammalian circadian clock[J]. Mol Cell, 2017, 67(5): 770-782.

9 Kriebs A, Jordan SD, Soto E,et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114(33): 8776-8781.

10 Giebultowicz JM. Circadian regulation of metabolism and healthspan in Drosophila[J]. Free Radic Biol Med, 2017. S0891-5849(17)31275-3.

11 Feng D, Lazar MA. Clocks, metabolism, and the epigenome [J]. Mol Cell, 2012, 47(2):158-167.

12 Partch CL, Green CB, Takahashi JS. Molecular architecture of the mammalian circadian clock[J]. Trends Cell Biol, 2014, 24(2): 90-99.

13 Dibner C, Schibler U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans[J]. J Intern Med, 2015, 277(5): 513-527.

14 Bass J. Circadian topology of metabolism[J]. Nature, 2012, 491(7424): 348-356.

15 Marcheva B, Ramsey KM, Peek CB,et al. Circadian clocks and metabolism[J]. Handb Exp Pharmacol, 2013, (217): 127-155.

16 Bailey SM, Udoh US, Young ME. Circadian regulation of metabolism[J]. J Endocrinol, 2014, 222(2): R75-96.

17 Asher G, Sassone-Corsi P. Time for food: the intimate interplay between nutrition, metabolism, and the circadian clock[J]. Cell, 2015, 161(1): 84-92.

18 Reinke H, Asher G. Circadian clock control of liver metabolic functions[J]. Gastroenterology, 2016, 150(3):574-580.

19 Keeling PJ, McCutcheon JP, Doolittle WF. Symbiosis becoming permanent: Survival of the luckiest[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(33): 10101-10103.

20 Gasch AP, Yu FB, Hose J,et al. Single-cell RNA sequencing reveals intrinsic and extrinsic regulatory heterogeneity in yeast responding to stress[J]. PLoS Biol, 2017, 15(12): e2004050.

21 Causton HC, Feeney KA, Ziegler CA,et al. Metabolic cycles in yeast share features conserved among circadian rhythms[J]. Curr Biol, 2015, 25(8): 1056-1062.

22 Wai T, Langer T. Mitochondrial dynamics and metabolic regulation[J]. Trends Endocrinol Metab, 2016, 27(2):105-117.

23 Uchiyama Y. Circadian alterations in tubular structures on the outer mitochondrial membrane of rat hepatocytes[J]. Cell Tissue Res, 1981, 214(3): 519-527.

24 Jacobi D, Liu S, Burkewitz K,et al. Hepatic Bmal1 regulates rhythmic mitochondrial dynamics and promotes metabolic ftness[J]. Cell Metab, 2015, 22(4): 709-720.

25 Andrews JL, Zhang X, McCarthy JJ,et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010, 107(44): 19090-190905.

26 Kohsaka A, Das P, Hashimoto I,et al. Te circadian clock maintains cardiac function by regulating mitochondrial metabolism in mice[J]. PLoS One, 2014, 9(11):e112811.

27 Oliva-Ramirez J, Moreno-Altamirano MM, Pineda-Olvera B,et al. Crosstalk between circadian rhythmicity, mitochondrial dynamics and macrophage bactericidal activity[J]. Immunology, 2014, 143(3): 490-497.

28 Neufeld-Cohen A, Robles MS, Aviram R,et al. Circadian control of oscillations in mitochondrial rate-limiting enzymes and nutrient utilization by PERIOD proteins[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016, 113(12): E1673-1682.

29 Magnone MC, Langmesser S, Bezdek AC,et al. Te mammalian circadian clock gene Per2 modulates cell death in response to oxidative stress[J]. Front Neurol, 2015, 5: 289.

30 Cotter D, Guda P, Fahy E,et al. MitoProteome: mitochondrial protein sequence database and annotation system[J]. Nucleic Acids Res, 2004, 32(Database issue):D463-467.

31 Taanman JW. Te mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication[J]. Biochim Biophys Acta, 1999, 1410(2): 103-123.

32 Mauvoisin D, Wang J, Joue C, et al. Circadian clock-dependent and -independent rhythmic proteomes implement distinct diurnal functions in mouse liver[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(1): 167-172.

33 Robles MS, Cox J, Mann M. In-vivo quantitative proteomics reveals a key contribution of post-transcriptional mechanisms to the circadian regulation of liver metabolism[J]. PLoS Genet, 2014, 10(1): e1004047.

34 Neufeld-Cohen A, Robles MS, Aviram R,et al. Circadian control of oscillations in mitochondrial rate-limiting enzymes and nutrient utilization by PERIOD proteins[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113(12): E1673-1682.

35 Kohsaka A, Das P, Hashimoto I,et al. The circadian clock maintains cardiac function by regulating mitochondrial metabolism in mice[J]. PLoS One, 2014, 9(11):e112811.

36 Gong C, Li C, Qi X,et al. The daily rhythms of mitochondrial gene expression and oxidative stress regulation are altered by aging in the mouse liver[J]. Chronobiol Int, 2015, 32(9): 1254-1263.

37 Koike N, Yoo SH, Huang HC,et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals[J]. Science, 2012, 338(6105): 349-354.

38 Jacobi D, Liu S, Burkewitz K,et al. Hepatic Bmal1 regulates rhythmic mitochondrial dynamics and promotes metabolic ftness[J]. Cell Metab, 2015, 22(4): 709-720.

39 Masri S, Patel VR, Eckel-Mahan KL,et al. Circadian acetylome reveals regulation of mitochondrial metabolic pathways[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(9):3339-3344.

40 Peek CB, Afnati AH, Ramsey KM,et al. Circadian clock NAD+ cycle drives mitochondrial oxidative metabolism in mice[J]. Science, 2013, 342(6158): 1243417.

41 Cela O, Scrima R, Pazienza V,et al. Clock genes-dependent acetylation of complex I sets rhythmic activity of mitochondrial OxPhos[J]. Biochim Biophys Acta, 2016, 1863(4): 596-606.

42 Osman C, Voelker DR, Langer T. Making heads or tails of phospholipids in mitochondria[J]. J Cell Biol, 2011, 192(1): 7-16.

43Aviram R, Manella G, Kopelman N,et al. Lipidomics analyses reveal temporal and spatial lipid organization and uncover daily oscillations in intracellular organelles[J]. Mol Cell, 2016, 62(4): 636-648.