石首地區(qū)野生麋鹿自然保護(hù)區(qū)重要病原菌(蟲(chóng))調(diào)查

王明月周東海* 郭定宗溫華軍李鵬飛郭 銳常 優(yōu)方 瑞

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢，430070；2.石首麋鹿國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，石首，434407；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢，430064)

麋鹿(Elaphurusdavidianus)原為中國(guó)獨(dú)有的物種，距今已有300萬(wàn)年的歷史。歷史上的麋鹿有5個(gè)種，現(xiàn)只有達(dá)氏種生存至今，其他物種均已滅絕[1-2]。1900年八國(guó)聯(lián)軍攻入北京，南海子麋鹿被西方列強(qiáng)掠奪一空，麋鹿在中國(guó)國(guó)土上基本滅絕。新中國(guó)成立后，中國(guó)政府希望能使麋鹿重回中國(guó)故鄉(xiāng)，但由于繁殖障礙，最初被引進(jìn)的2只麋鹿一直未能順利繁殖。1985年北京麋鹿生態(tài)實(shí)驗(yàn)中心從英國(guó)烏邦寺引進(jìn)麋鹿38頭，使得麋鹿重回故鄉(xiāng)[3]?，F(xiàn)階段麋鹿為中國(guó)國(guó)家Ⅰ級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物。發(fā)展至今，中國(guó)已擁有江蘇大豐野生麋鹿群、湖北石首野生麋鹿群和洞庭湖野生麋鹿群3大野生麋鹿種群[1]。

經(jīng)過(guò)多年的努力，野生麋鹿種群得到了快速的增長(zhǎng)。但由于野生麋鹿生存環(huán)境的特殊性和麋鹿本身的生物學(xué)特性，使得在野生麋鹿疾病的治療和管理上困難重重。2010～2011年，石首麋鹿自然保護(hù)區(qū)野生麋鹿大量死亡。由于當(dāng)時(shí)麋鹿數(shù)量多達(dá)700余頭，超過(guò)保護(hù)區(qū)存載量，環(huán)境自然降解能力降低，劇烈的天氣變化等客觀因素和保護(hù)區(qū)缺乏防疫基礎(chǔ)設(shè)施、定期的疫病監(jiān)測(cè)和有效的監(jiān)測(cè)手段等主觀因素共同影響，使得麋鹿大規(guī)模暴發(fā)疫病[4]。麋鹿作為珍稀動(dòng)物，對(duì)它保護(hù)所帶來(lái)環(huán)境生態(tài)效益是難以估量的，其對(duì)生物多樣性保護(hù)意義遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)單一物種的生存和繁衍問(wèn)題。對(duì)麋鹿及其自然棲息地的保護(hù)促進(jìn)了整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)，推動(dòng)了中國(guó)野生動(dòng)物保護(hù)事業(yè)的發(fā)展。麋鹿作為重要的可再生保護(hù)資源，是極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的動(dòng)物。本文通過(guò)調(diào)查石首麋鹿自然保護(hù)區(qū)內(nèi)重要病原菌和寄生蟲(chóng)的感染情況，對(duì)于建立完善的疫病防控體系，保護(hù)區(qū)進(jìn)行合理科學(xué)的管理規(guī)劃具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料

2016年8月采集的麋鹿糞便11份。

2016年8月采集的病死麋鹿臟器：包含肺臟、腎臟、肝臟、脾臟、腸管等。

2016年12月采集的麋鹿糞便12份。

(本試驗(yàn)所使用的病料均由湖北石首野生麋鹿自然保護(hù)區(qū)工作人員提供)。

1.1.2 試驗(yàn)藥品及儀器

光學(xué)顯微鏡；顯微攝影成像系統(tǒng)；PCR儀；電腦三恒多用電泳儀；超凈工作臺(tái)；電熱恒溫培養(yǎng)箱；高級(jí)凝膠成像系統(tǒng)。

TSA培養(yǎng)基；SS培養(yǎng)基；EMS培養(yǎng)基；MAC培養(yǎng)基；厭氣肉肝湯；營(yíng)養(yǎng)肉湯；Mueller-Hinton瓊脂；脫脂綿羊血(以上試劑均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司)；16S rRNA上下游引物；PCR Mix(以上試劑均購(gòu)自武漢擎科生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化及形態(tài)學(xué)觀察

無(wú)菌條件下，將糞便樣品接種于TSA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h，挑取不同菌落分別接種于TSA培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、MAC培養(yǎng)基和EMS培養(yǎng)基上并編號(hào)，37℃培養(yǎng)18 h。無(wú)菌條件下，切開(kāi)臟器，用接種環(huán)刮取臟器內(nèi)表面滲出液，分別接種于鮮血平板和TSA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落的生長(zhǎng)情況及細(xì)菌的溶血情況。挑取不同菌落分別接種于TSA培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、MAC培養(yǎng)基和EMS培養(yǎng)基上并編號(hào)，37℃培養(yǎng)18 h。

觀察菌落形態(tài)和特點(diǎn)，挑取不同的單菌落，革蘭氏染色鏡檢，觀察顯微鏡下細(xì)菌形態(tài)。記錄形態(tài)，采集圖像。挑取單菌落，接于NB肉湯中，搖床中富集18 h。

1.2.2 分離菌株的16S rRNA PCR鑒定

PCR檢測(cè)：于PCR管中加入無(wú)菌蒸餾水9 μL，Mix 12 μL，16S-f1 μL，16S-r1 μL，培養(yǎng)18 h的菌液2 μL，制成25 μL反應(yīng)系統(tǒng)，混勻，振蕩，離心。

PCR擴(kuò)增條：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火60 s、72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取4 μL的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠(每100 mL 1%的TAE加入5 μL的EB)電泳，電壓160 V，置于凝集成像系統(tǒng)下拍照。

PCR測(cè)序：將電泳跑出明顯條帶的菌液送至武漢擎科創(chuàng)新生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 寄生蟲(chóng)檢查方法

1.2.3.1 飽和食鹽水浮聚法

取少量糞便和適量飽和食鹽水于研缽中研磨后，置于5 mL一次性玻璃瓶中，慢慢往瓶中加入飽和食鹽水，直至液面為凸液面而不溢出，在瓶口覆蓋一載玻片，靜止15 min后，將載玻片提起并迅速翻轉(zhuǎn)，蓋上蓋玻片，鏡檢。

1.2.3.2 沉淀集卵法

取10 g糞便于研缽中，加入少量清水充分研磨，經(jīng)80目金屬分樣篩過(guò)濾至50 mL燒杯中，加入清水至杯口，靜止15 min，倒去上清，重新加滿(mǎn)水，靜置15 min，如此重復(fù)3次，最后倒去上清液，用滴管吸取底層沉渣滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，鏡檢。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

2.1.1 細(xì)菌形態(tài)

從采集的糞便樣品和病死麋鹿臟器中共分到8類(lèi)菌，其在營(yíng)養(yǎng)瓊脂的生長(zhǎng)情況和革蘭氏染色結(jié)果如下。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)在TSA培養(yǎng)基上生成圓形菌落，邊緣光滑，灰白色菌落；顯微鏡下觀察到的結(jié)果，革蘭陰性菌，菌體呈短桿狀(圖1，左圖)。志賀桿菌(Shigabacillus)在TSA培養(yǎng)基上為透明、圓形的小菌，在MAC上為無(wú)色菌落，顯微鏡下觀察到的結(jié)果，革蘭陰性菌，直桿菌(圖1，右圖)。

圖1 嗜水氣單胞菌(左圖)；志賀桿菌(右圖)Fig.1 Aeromonas hydrophila(left)；Shigella(right)

圖2 蠟樣芽孢桿菌(左圖)；大腸桿菌(右圖)Fig.2 Bacillus cereus(left)；Escherichia coli(right)

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)在TSA培養(yǎng)基上形成近似圓形的白色有光澤菌落，在血瓊脂培養(yǎng)基上為邊緣不整齊的毛玻璃狀灰白色菌落；顯微鏡下觀察到的結(jié)果，革蘭氏陽(yáng)性桿菌，菌體細(xì)胞桿狀，末端方(圖2，左圖)。大腸桿菌(Escherichiacoli)在TSA上為光滑濕潤(rùn)半透明菌落，EMS上生成黑色有金屬光澤的菌落，MAC上為粉紅色菌落；顯微鏡下觀察到的結(jié)果，革蘭氏陰性短桿菌(圖2，右圖)。

圖3 鏈球菌(左圖)；糞腸球菌(右圖)Fig.3 Streptococcus(left)；Enterococcus faecalis(right)

鏈球菌(Streptococcus)在TSA上不生長(zhǎng)，在鮮血培養(yǎng)基上形成透明溶血現(xiàn)象，生長(zhǎng)良好；顯微鏡下觀察到的結(jié)果，革蘭氏染色陽(yáng)性，球形或卵圓形，呈鏈狀排列(圖3，左圖)。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)在TSA培養(yǎng)基上生成半透明、濕潤(rùn)的小菌落；顯微鏡下觀察到的結(jié)果，革蘭氏染色陽(yáng)性，卵圓形菌(圖3，右圖)。

圖4 產(chǎn)氣莢膜梭菌(左圖)；乳酸桿菌(右圖)Fig.4 Clostridium perfringens(left)；Lactobacillus(right)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)在厭氣肉肝湯液體培養(yǎng)基中，產(chǎn)生氣體；顯微鏡下觀察到的結(jié)果，革蘭氏染色陽(yáng)性，大腸桿菌，兩頭鈍圓，菌體卵圓形(圖4，左圖)。乳酸桿菌(Lactobacillus)在TSA培養(yǎng)基上形成白色不透明小菌落，邊緣不光滑，生長(zhǎng)良好；顯微鏡下觀察到的結(jié)果，革蘭氏顏色陽(yáng)性，菌體桿狀，單個(gè)或呈短鏈存在(圖4，右圖)。

2.1.2 PCR測(cè)序結(jié)果

如圖5所示，4、6、7、11泳道為大腸桿菌電泳結(jié)果，5泳道為嗜水氣單胞菌電泳結(jié)果，10泳道為糞腸球菌電泳結(jié)果，12泳道為蠟樣芽孢桿菌電泳結(jié)果，15泳道為志賀桿菌電泳結(jié)果。

將PCR產(chǎn)物送檢測(cè)序，結(jié)果與NCBI參考菌種16S rRNA基因核酸序列進(jìn)行同源性分析比較，得出乳酸桿菌、大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、嗜水氣單胞菌、糞腸球菌、志賀桿菌和鏈球菌的

核苷酸序列同源性均在97%～100%之間。結(jié)合菌株鏡檢形態(tài)和生長(zhǎng)特性，從而確定分離得到純培養(yǎng)菌株的種屬。

圖5 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoretic results of PCR products

2.2 寄生蟲(chóng)鑒定結(jié)果

在2016年8月收集的11份樣品中，共檢測(cè)到3種蟲(chóng)卵。

血矛線蟲(chóng)(Haemonchuscontortus)卵，呈橢圓形，平均大小70 μm×50 μm，卵殼光滑且薄，卵內(nèi)含8～10個(gè)胚細(xì)胞(圖6，A圖)，檢出率為1/11。前后盤(pán)吸蟲(chóng)(Paramphistomum)卵，呈橢圓形，平均大小125 μm×90 μm，淺灰色，卵黃未充滿(mǎn)整個(gè)蟲(chóng)卵(圖6，B圖)，檢出率為2/11。貝氏莫尼茨絳蟲(chóng)(Monieziabenedeni)卵，呈不規(guī)則四角形，平均大小40 μm×55 μm卵內(nèi)有特殊的梨形器，器內(nèi)含六鉤蚴(圖6，C圖)，檢出率為1/11。

在2016年12月收集的11份樣品中，未檢測(cè)到蟲(chóng)卵。

圖6 A圖，血矛線蟲(chóng)卵(卵圓形，小于100 μm)；B圖，前后盤(pán)吸蟲(chóng)卵(卵圓形，大于100 μm)；C圖，貝氏莫尼茨絳蟲(chóng)卵(不規(guī)則四角形，小于100 μm)Fig.6 A，Haemonchus contortus egg(oval，less than 100 μm)；B，Paramphistomum egg(oval，more than 100 μm)；C，Moniezia benedeni egg(irregular quadrangle，less than 100 μm)

3 討論

3.1 病原菌結(jié)果討論

本研究通過(guò)對(duì)2016年8月和2016年12月的兩批樣本進(jìn)行病原菌分離鑒定，得到大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、志賀桿菌、蠟樣芽孢桿菌、鏈球菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和乳酸桿菌8種細(xì)菌，其中糞腸球菌、乳酸桿菌和大腸桿菌為正常存在于腸道的菌種，且乳酸桿菌為益生菌，而大腸桿菌為機(jī)會(huì)致病菌。嗜水氣單胞菌廣泛存在于水源和水生動(dòng)物體內(nèi)，是一種條件致病菌，在條件合適的情況下會(huì)產(chǎn)生外毒素，如溶血素、腸毒素等，對(duì)麋鹿的健康存在一定的威脅[5]。

在病死麋鹿病料中分離得到的志賀桿菌、蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和鏈球菌均能導(dǎo)致麋鹿生病甚至死亡。蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于麋鹿生活地區(qū)的水域和土壤中，同樣可存在于麋鹿食用的食物中和麋鹿的腸道內(nèi)，其產(chǎn)生的腸毒素，可引起麋鹿的中毒性腹瀉。產(chǎn)氣莢膜梭菌是一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性菌，可存在于麋鹿可飼食物中和水體中，主要導(dǎo)致動(dòng)物腸毒血癥，張林源等[6]研究中曾報(bào)道該菌引起麋鹿大量死亡的事實(shí)。鏈球菌主要通過(guò)飛沫傳播，在麋鹿病料中分離到的鏈球菌為溶血性鏈球菌，此類(lèi)鏈球菌致病力強(qiáng)，引起動(dòng)物的肺炎、腎炎、敗血癥等疾病，對(duì)麋鹿的健康存在嚴(yán)重的威脅。志賀桿菌又稱(chēng)痢疾桿菌，通過(guò)食物和水源傳播，夏秋季感染性較高，可引起動(dòng)物機(jī)體腹瀉。

3.2 寄生蟲(chóng)結(jié)果討論

2016年8月麋鹿糞便寄生蟲(chóng)卵檢測(cè)陽(yáng)性率為23.3%(3/11)，而2016年12月麋鹿糞便樣本均未檢出寄生蟲(chóng)卵。兩批樣本結(jié)果的差異，可能是由于季節(jié)因素導(dǎo)致的。湖北石首麋鹿自然保護(hù)區(qū)位于N29°25′，E112°14′，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫為15.9℃～16.6℃[7]。8月正值夏季，降雨量大，平均氣溫高，環(huán)境條件適合寄生蟲(chóng)傳播和繁殖。而12月正值冬季，氣溫相對(duì)較低，寄生蟲(chóng)存活率低，所以麋鹿感染寄生蟲(chóng)的概率有很大程度的降低。

此次調(diào)查檢測(cè)出的腸道寄生蟲(chóng)蟲(chóng)卵主要為前后盤(pán)吸蟲(chóng)卵、貝氏莫尼茨絳蟲(chóng)卵和血矛線蟲(chóng)卵。由于麋鹿擅長(zhǎng)游泳，且石首位于濕地生態(tài)系統(tǒng)，區(qū)內(nèi)分布多種淡水螺，為吸蟲(chóng)的傳播提供了大量中間宿主，所以石首地區(qū)的麋鹿吸蟲(chóng)的檢出率相對(duì)于其他地區(qū)較高[8]。貝氏莫尼茨絳蟲(chóng)在綿羊體內(nèi)的檢出率較高[9]，而關(guān)于鹿科動(dòng)物，該蟲(chóng)寄生的相關(guān)報(bào)道較少。血矛線蟲(chóng)寄生于反芻動(dòng)物皺胃，在野生反芻動(dòng)物中檢出的報(bào)道較多，在鹿科動(dòng)物寄生蟲(chóng)調(diào)查中也曾報(bào)道[10]。

3.3 疫病防控體系建立討論

根據(jù)此次調(diào)查結(jié)果，現(xiàn)提出以下疫病防控建議：

建議保護(hù)區(qū)內(nèi)工作人員對(duì)麋鹿活動(dòng)地區(qū)水體、土壤進(jìn)行定期消毒，適當(dāng)選擇消毒液種類(lèi)；注重疫病防控，安排人員定期統(tǒng)計(jì)保護(hù)區(qū)內(nèi)麋鹿發(fā)病率和死亡率；于保護(hù)區(qū)工作站配備專(zhuān)業(yè)的獸醫(yī)，能在疫病發(fā)生第一時(shí)間做出準(zhǔn)確診斷，并能提出針對(duì)性的治療方案；針對(duì)麋鹿地區(qū)存在的重要致病菌和寄生蟲(chóng)，配備相應(yīng)敏感抗生素和驅(qū)蟲(chóng)藥物，對(duì)發(fā)病動(dòng)物進(jìn)行人工干預(yù)治療；對(duì)死亡麋鹿，合理地進(jìn)行無(wú)害化處理。

[1] 丁玉華，任義軍，溫華軍，等.中國(guó)野生麋鹿種群的恢復(fù)與保護(hù)研究[J].野生動(dòng)物學(xué)報(bào)，2014，35(2)：228-233.

[2] 丁玉華.中國(guó)麋鹿研究[M].吉林：吉林科學(xué)技術(shù)出版社，2004.

[3] 新華網(wǎng).麋鹿回歸20年：命運(yùn)多舛話麋鹿[EB/OL].(2005-08-25).http：//news.sina.com.cn/s/2005-08-25/18386782089s.shtml.

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