HPLC法測(cè)定不同產(chǎn)地花生根中白藜蘆醇含量

劉臣 唐長(zhǎng)波

摘要 為建立花生根中白藜蘆醇的高效液相色譜含量測(cè)定方法，采用HPLC法進(jìn)行了試驗(yàn)，色譜條件為Shimpack C18色譜柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（52∶48）；檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。結(jié)果表明，白藜蘆醇進(jìn)樣量在0.2～1.0 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=6 215.3X-65.647，r=0.999 8；平均回收率為99.21%；RSD為0.97%。該方法靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于花生根的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 HPLC；花生根；白藜蘆醇；含量測(cè)定

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2018）03-0247-02

Abstract A resverse-phase high performance 1iquid chromatography（HPLC）method was developed to determine resveratrol content in peanut root.The separation was performed on the following condition：a Shimpack C18 column（150.0 mm×4.6 mm，5 μm），the mobile phase of methanol-water（52∶48），flow rate was 1.0 mL/min and the detecfion wavelength was 306 nm，the injection volume was 10 μL and column temperature was 30 ℃.The results showed that there was a good linear relationship between the area and the injection volume of resveratrol from 0.2 μg to 1.0 μg.The corresponding regression equation was Y=6 215.3X-65.647，r=0.999 8.The average recovery was 99.21% and RSD was 0.97%.The method is sensitive，accurate and speedy，therefore it is suitable for quality control of peanut root.

Key words HPLC；peanut root；resvemtrol；content determination

白藜蘆醇富含于虎杖、葡萄、花生等植物中，是植物受到環(huán)境壓力、真菌、細(xì)菌感染等病理性因素攻擊時(shí)產(chǎn)生的一種植物抗毒素。目前有關(guān)白藜蘆醇功能的研究相當(dāng)多[1-2]，它具有抗菌、抗癌、抗氧化、抑制血小板凝集和血管舒張、調(diào)節(jié)脂蛋白代謝、提高機(jī)體免疫力等特性，被認(rèn)為是最有希望的化學(xué)預(yù)防抗癌劑。近年來(lái)，不少學(xué)者對(duì)花生各部分及相關(guān)產(chǎn)品白藜蘆醇的含量進(jìn)行了研究測(cè)定[3-4]，結(jié)果顯示，花生植物的根、莖等非食用部位白藜蘆醇含量相當(dāng)高（根中白藜蘆醇的含量最高可達(dá)1.33 mg/g），是花生仁的數(shù)十倍乃至數(shù)百倍，是紅葡萄酒中含量的數(shù)百倍，是天然白藜蘆醇的重要植物源。關(guān)于白藜蘆醇的常用檢測(cè)方法有薄層熒光掃描法、分子熒光法、HPLC法[5-8]等。由于前2種方法靈敏度不高、操作步驟復(fù)雜、方法的重現(xiàn)性較差，使得檢測(cè)結(jié)果誤差很大，也曾有人采用HPLC法檢測(cè)，但在樣品的前處理過(guò)程中，只是進(jìn)行簡(jiǎn)單的溶劑提取，而未對(duì)樣品做進(jìn)一步的純化處理，使得在檢測(cè)過(guò)程中大量的雜質(zhì)殘留在色譜柱中，對(duì)色譜柱損傷嚴(yán)重，而且在最后得到的色譜圖中白藜蘆醇峰與雜質(zhì)峰之間的分離度較差。本試驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法建立了快速、簡(jiǎn)便、易行的樣品前處理方法，對(duì)不同產(chǎn)地花生根中白藜蘆醇含量進(jìn)行了測(cè)定，并進(jìn)行了方法學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器。高效液相色譜儀（配有P230+紫外檢測(cè)器、P230/P230p高壓恒泵，EC2000色譜工作站），大連依利特分析儀器有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；Sartorius CPA225D電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司。

1.1.2 試藥。白藜蘆醇對(duì)照品，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純?；ㄉ?，均購(gòu)于藥材批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)過(guò)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)家鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試品溶液的制備。取花生根，粉碎，過(guò)60目篩，精密稱(chēng)取2.0 g，加60%乙醇于40 ℃水浴超聲振蕩提取30 min，共提取2次，過(guò)濾，殘?jiān)蒙倭?0%乙醇洗滌，與2次提取液合并，減壓回收乙醇，殘留物用30 mL乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯提取液，減壓回收至干，用甲醇定容至10 mL棕色量瓶中，備用。臨進(jìn)樣前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取白藜蘆醇對(duì)照品適量，置于10 mL棕色量瓶中，加入甲醇配制成每1 mL中含白藜蘆醇100 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的測(cè)定。取白藜蘆醇對(duì)照品適量，加入甲醇配制成每1 mL中含白藜蘆醇0.1 mg的溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.2.4 HPLC測(cè)定條件。色譜柱：Shimpak C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（52∶48）；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外光譜掃描結(jié)果顯示，白藜蘆醇在306 nm波長(zhǎng)處有最大吸收（圖1），故選擇306 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 色譜條件優(yōu)化結(jié)果

在上述色譜條件下，樣品液相色譜圖中，白藜蘆醇與其他組分的色譜峰分離度良好，峰形對(duì)稱(chēng)（圖2）。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察。分別吸取對(duì)照品溶液2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL，按上述確定的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以對(duì)照品的進(jìn)樣量X（μg）對(duì)峰面積Y進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。上述結(jié)果表明，白藜蘆醇進(jìn)樣量在0.2～1.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖3），其線性方程為：Y=6 215.3X-65.647，r=0.999 8。

2.3.2 精密度試驗(yàn)。取上述白藜蘆醇對(duì)照品溶液5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD值（表2），結(jié)果表明，6次進(jìn)樣峰面積的RSD值為0.86%，說(shuō)明該方法的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明，峰面積RSD為1.15%（表3），說(shuō)明供試品溶液在8 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)。取同一批花生根樣品，精密稱(chēng)取6份，每份2.0 g，按供試品溶液的制備方法處理，精密吸取10 μL，進(jìn)行HPLC分析（表4），結(jié)果表明，6次測(cè)定含量分別為0.212 6、0.214 5、0.215 1、0.217 3、0.213 4、0.218 9 mg/g，RSD為1.11%，說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好。

2.3.5 回收率試驗(yàn)。精密稱(chēng)取已知含量的供試品9份，每份各1.0 g，分別加入濃度為0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液1.6、2.0、

2.4 mL，按供試品的制備方法制成供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，9份樣品的回收率均在98.10%～100.63%之間，平均回收率為99.21%，RSD為0.97%，說(shuō)明該方法回收率良好。

2.3.6 樣品的含量測(cè)定。取不同產(chǎn)地的花生根藥材，按供試品溶液的制備方法處理，各進(jìn)樣10 μL進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

3 結(jié)論與討論

以甲醇-水（52∶48）為流動(dòng)相，白藜蘆醇與雜質(zhì)峰得到很好的分離，且流動(dòng)相配制操作簡(jiǎn)便。

在樣品的前處理上，優(yōu)選超聲振蕩提取的方式，優(yōu)于傳統(tǒng)加熱回流提取的方法，使操作簡(jiǎn)便易行，提取率高。在提取溶劑的選擇上，對(duì)甲醇和乙醇的各種濃度比例進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果選擇以60%乙醇為最佳提取溶劑。由于白藜蘆醇不穩(wěn)定，受光照和溫度影響很大，故在樣品制備過(guò)程中，對(duì)提取溫度也進(jìn)行了選擇。在20、40、60、80 ℃的條件下，樣品超聲提取后用HPLC法測(cè)定，結(jié)果表明，當(dāng)提取溫度大于40 ℃時(shí)，白藜蘆醇含量明顯下降并出現(xiàn)雜質(zhì)峰。因此，提取溫度宜選擇40 ℃。

由于白藜蘆醇難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯，故本試驗(yàn)采用乙酸乙酯作為萃取劑對(duì)樣品進(jìn)行純化，以去除水溶性雜質(zhì)，從而降低了對(duì)色譜柱的污染程度，增加了白藜蘆醇與雜質(zhì)峰之間的分離度，效果明顯。

通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地藥材的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地之間，白藜蘆醇含量相差較大。因此，在臨床使用時(shí)，要對(duì)花生根進(jìn)行全面的質(zhì)量分析與控制。

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