ZNF267在膀胱癌中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響

曹正，邱明星

（西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000）

在中國膀胱癌發(fā)病率居泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位[1-2]。膀胱移行細(xì)胞癌（transitional cell carcinoma，TCC）是膀胱癌最常見的類型，部分患者將發(fā)展為肌層侵襲性膀胱癌[1-2]?；熆捎行Э刂撇糠旨忧忠u性膀胱癌，但無法提高大部分患者的生存期[3]。因此，闡明膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制顯得尤為重要。Kruppel樣因子家族分子可調(diào)控多項(xiàng)生理進(jìn)程[4]。鋅指蛋白267（zinc finger protein 267，ZNF267）是Kruppel鋅指家族成員，研究顯示ZNF267在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用[5-6]。然而，尚無研究闡明ZNF267在膀胱癌中的表達(dá)及其功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司），青霉素-鏈霉素雙抗（美國HyClone公司），胎牛血清（美國Gibco公司）。逆轉(zhuǎn)錄及RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）所應(yīng)用的 Real Master試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Annexin-V及PI抗體（美國Biolegend公司），Tranwell小室（美國Milipore公司），人膀胱癌細(xì)胞系T24、BIU87及人膀胱上皮永生化細(xì)胞系SV-HUC-1（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。

1.2 主要儀器

液氮灌、細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，ABI 7900型PCR儀（美國ABI公司），BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 組織標(biāo)本 14例TCC組織及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本來自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科。14例患者在根治性切除術(shù)后經(jīng)病理診斷為TCC。所有入組患者同意本研究使用其組織標(biāo)本，并簽署知情同意書及授權(quán)書。本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。標(biāo)本收集后，儲(chǔ)存于液氮罐中。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌細(xì)胞系T24、BIU87，以及人膀胱上皮永生化細(xì)胞系SV-HUC-1用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的1640培養(yǎng)基，所有細(xì)胞置于37℃、5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3.3 RNA提取 Trizol裂解人TCC組織或細(xì)胞系，4℃、12 000 r/min離心15 min，吸取水相層，加入等體積的異丙醇。4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，所得膠狀沉淀即為RNA。

1.3.4 qRT-PCR 采用qRT-PCR反應(yīng)檢測TCC組織和細(xì)胞系中ZNF267的相對(duì)表達(dá)量，以及ZNF267在TCC細(xì)胞中的干涉效率。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。將125μl 20xSYBR溶液加入1.0 ml 2.5x Real Master Mix中，所得溶液作為試劑A。實(shí)驗(yàn)采用20μl體系，內(nèi)含 9μl試劑 A，1μl 20x ROX Reference Dye，1μl正向引物，1μl反向引物，cDNA模板2μl，6μl去離子水。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。ZNF267正向引物：5′-ATGGGAGCTGTGATCTTGAGA，反向引物：5′-GCAATGATGAATGAGTAAAGACC；β-actin正向引物：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，反向引物：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。ZNF267相對(duì)表達(dá)量 ：2-ΔΔCt=CtZNF267-Ctβ-actin。

1.3.5 CCK-8法 采用CCK-8增殖試劑盒檢測轉(zhuǎn)染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA的TCC細(xì)胞增殖情況。取對(duì)數(shù)生長期的人TCC細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以2.0×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)8個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)1～5 d，加入10μl/孔的CCK-8試劑，培養(yǎng)4 h后，在450 nm波長處測定吸光度值，所得數(shù)據(jù)作為第1天的OD值。而后每天在同一時(shí)間再次測定吸光度值，根據(jù)5 d內(nèi)各組所測OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù) 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA的TCC細(xì)胞周期情況。取對(duì)數(shù)生長期的人TCC細(xì)胞，制備為單細(xì)胞懸液。10 ml PBS，1 000 r/min離心10 min，反復(fù)洗滌3次，棄上清；若檢測細(xì)胞周期，則在各組細(xì)胞中加入100μl流式洗液和50μg/ml PI 5μl，或同型對(duì)照抗體，避光反應(yīng)15 min。采用尼龍膜過濾細(xì)胞，除去細(xì)胞團(tuán)塊后，立即用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測。若檢測細(xì)胞凋亡，則在清洗細(xì)胞后加入FITC標(biāo)記的20μg/ml Annexin-V 10μl和 50μg/ml PI 5μl，或 Annexin-V 及PI的同型對(duì)照抗體，避光反應(yīng)15 min。采用尼龍膜過濾細(xì)胞，除去細(xì)胞團(tuán)塊后，立即利用BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲實(shí)驗(yàn) ①細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA的TCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。Transwell小室內(nèi)加入100μl密度為1×105個(gè)/ml的無血清腫瘤細(xì)胞懸液，下室加入500μl含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。24 h后甲醇固定，結(jié)晶紫染色，切下Transwell膜，封片。②細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA的TCC細(xì)胞侵襲能力。Transwell小室預(yù)先鋪基質(zhì)膠，其余步驟同細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差分析或t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZNF267在人TCC組織及細(xì)胞系中的表達(dá)

2.1.1 TCC組織 14例TCC組織中ZNF267 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為（3.743±1.513），14例癌旁組織為（1.107±0.539），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.947，P=0.036），TCC組織中ZNF267 mRNA的表達(dá)水平高于癌旁組織。見圖1。

2.1.2 細(xì)胞系 ZNF267 mRNA在人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1中的相對(duì)表達(dá)水平為（1.000±0.050），在人TCC細(xì)胞系T24和BIU-87細(xì)胞中分別為（2.327±0.044）和（3.146±0.036），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.895，P=0.027）。人TCC細(xì)胞系中ZNF267的表達(dá)水平高于人膀胱上皮永生化細(xì)胞。見圖2。

2.2 ZNF267 siRNA在TCC細(xì)胞中的沉默效率

2.2.1 T24細(xì)胞 人膀胱癌細(xì)胞系T24中ZNF267-NC組的ZNF267 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為（1.000±0.05），ZNF267 siRNA 組為（0.384±0.061），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.176，P=0.032），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖3A。

2.2.2 BIU87細(xì)胞 人膀胱癌細(xì)胞系BIU87中ZNF267-NC組的ZNF267 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為（1.000±0.05），ZNF267 siRNA 組為（0.417±0.031），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.175，P=0.038），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖3B。

圖1 ZNF267在人TCC組織中的表達(dá)

2.3 ZNF267對(duì)TCC細(xì)胞增殖的影響

2.3.1 T24細(xì)胞 轉(zhuǎn)染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA后第3天起，T24細(xì)胞中ZNF267 siRNA組的OD值為（0.517±0.061），ZNF267-NC組為（0.982±0.067），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.518，P=0.031），ZNF267 siRNA組低于ZNF267-NC組。見圖4A。

2.3.2 BIU87細(xì)胞 轉(zhuǎn)染ZNF267-NC和ZNF267 siRNA后3天起，BIU87細(xì)胞中ZNF267 siRNA組的OD值為（0.841±0.053），ZNF267-NC 組為（1.176±0.071），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.107，P=0.036），ZNF267 siRNA組低于ZNF267-NC組。見圖4B。

2.4 ZNF267對(duì)TCC細(xì)胞凋亡的影響

2.4.1 T24細(xì)胞 ZNF267-NC組的T24細(xì)胞凋亡 率 為（1.713±0.232）%，ZNF267 siRNA組 為（8.153±2.348）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.416，P=0.021），ZNF267-NC組低于ZNF267 siRNA組。見圖5A。

2.4.2 BIU87細(xì)胞 ZNF267-NC組的BIU87細(xì)胞凋亡率為（0.913±0.481）%，ZNF267 siRNA組為（11.329±3.591）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.461，P=0.016），ZNF267-NC組低于ZNF267 siRNA組。見圖5B。

2.5 ZNF267對(duì)TCC細(xì)胞周期的影響

圖2 ZNF267在人TCC細(xì)胞系中的表達(dá)

圖3 ZNF267 siRNA在TCC細(xì)胞中的沉默效率

圖4 ZNF267對(duì)TCC細(xì)胞增殖的影響

2.5.1 T24細(xì)胞 轉(zhuǎn)染ZNF267-NC的T24細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比為（41.164±3.247）%，轉(zhuǎn)染ZNF267 siRNA為（56.838±3.546）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.147，P=0.027），ZNF267 siRNA組細(xì)胞周期與ZNF267-NC組比較，阻滯于G1期，細(xì)胞增殖受抑制。見圖6A。

2.5.2 BIU87細(xì)胞 轉(zhuǎn)染ZNF267-NC的BIU-87細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比為（47.363±3.254）%，轉(zhuǎn)染ZNF267 siRNA為（62.663±2.581）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.149，P=0.031），ZNF267 siRNA組細(xì)胞周期與ZNF267-NC組比較，阻滯于G1期，細(xì)胞增殖受抑制。見圖6B。

2.6 ZNF267對(duì)TCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

2.6.1 T24細(xì)胞 ZNF267-NC組的T24細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞增加（1.000±0.032） 倍，ZNF267 siRNA組為（0.353±0.083）倍，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.775，P=0.034），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖7A。

2.6.2 BIU87細(xì)胞 ZNF267-NC組的BIU87細(xì)胞轉(zhuǎn)移細(xì)胞增加（1.000±0.028）倍，ZNF267 siRNA組為（0.215±0.035）倍，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.648，P=0.018），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖7B、C。

2.7 ZNF267對(duì)TCC細(xì)胞侵襲能力的影響

圖5 ZNF267對(duì)TCC細(xì)胞凋亡的影響

圖6 ZNF267對(duì)TCC細(xì)胞周期的影響

圖7 ZNF267對(duì)TCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

2.7.1 T24細(xì)胞 ZNF267-NC組的T24細(xì)胞侵襲細(xì)胞增加（1.000±0.044） 倍，ZNF267 siRNA組為（0.321±0.931）倍，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.106，P=0.011），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖8A。

2.7.2 BIU87細(xì)胞 ZNF267-NC組的BIU87細(xì)胞侵襲細(xì)胞增加（1.000±0.048）倍，ZNF267 siRNA組為（0.258±0.125）倍，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.451，P=0.008），ZNF267-NC組高于ZNF267 siRNA組。見圖8B、C。

圖8 ZNF267對(duì)TCC細(xì)胞侵襲的影響

3 討論

ZNF267 Kruppel樣鋅指家族成員，其結(jié)構(gòu)包括一個(gè)氨基酸末端的高度保守的Kruppel相關(guān)盒結(jié)構(gòu)域，并通過連接區(qū)與鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)分隔[7]。研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮NO治療后，靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中ZNF267 mRNA表達(dá)水平上調(diào)[8]。此外，在肝星狀細(xì)胞活化過程及肝硬化組織中ZNF267的表達(dá)同樣上調(diào)[5]。更為重要的是，研究證實(shí)ZNF267在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[6]。然而，尚無研究闡明ZNF267在TCC中的表達(dá)及功能。本課題研究發(fā)現(xiàn)，ZNF267在TCC組織中的表達(dá)高于癌旁組織。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZNF267在TCC細(xì)胞系中的表達(dá)亦高于永生化膀胱上皮細(xì)胞。利用RNA干涉技術(shù)沉默TCC細(xì)胞中ZNF267的表達(dá)后，TCC細(xì)胞增殖受抑制，而凋亡能力增強(qiáng)。研究還發(fā)現(xiàn)，沉默ZNF267在TCC中表達(dá)后，細(xì)胞周期被阻滯于G1期；細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力也受到抑制。本研究首次闡明ZNF267在TCC組織及細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)TCC細(xì)胞功能的影響。

既往研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子Ets-1為ZNF267的關(guān)鍵調(diào)控分子，可誘導(dǎo)ZNF267表達(dá)上調(diào)[6]。Ets-1可通過活化基質(zhì)金屬蛋白酶和尿激酶型溶酶原活化物等多種酶的轉(zhuǎn)錄，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[9-11]。研究發(fā)現(xiàn)Ets-1在TCC組織中的表達(dá)高于癌旁組織，且特異性干涉Ets-1表達(dá)后，TCC的惡性表型受抑制。Ets-1在TCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮促癌分子作用[12]。TCC中高表達(dá)的Ets-1轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo)ZNF267的表達(dá)上調(diào)，從而使ZNF267發(fā)揮促癌分子作用。ZNF267表達(dá)水平的另一調(diào)控機(jī)制為HIF-1α通過調(diào)控Ets-1而間接調(diào)控ZNF267的表達(dá)。研究顯示，抑制Ets-1在肝細(xì)胞活性的重要調(diào)控分子缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）[13]，則ZNF267在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)亦降低。缺氧可提高肝細(xì)胞癌中HIF-1α的表達(dá)[14]，并促進(jìn)ZNF267的表達(dá)。在膀胱癌中，HIF-1α亞基與膀胱癌的分期、分級(jí)及轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)[15]。HIF-1α及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1為膀胱癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)[16-17]。根據(jù)本研究結(jié)果，HIF-1α可能亦通過間接上調(diào)ZNF267的表達(dá)，而促進(jìn)膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展。ZNF267參與Ets-1和HIF-1α調(diào)控TCC發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，ZNF267在膀胱癌組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，沉默其表達(dá)后，細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲受抑制，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，細(xì)胞周期被阻滯于G1期。本研究為闡明ZNF267在TCC發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為膀胱癌的治療提供潛在可利用的分子靶點(diǎn)。

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