三七護(hù)肝膠囊對小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用

程云飛，呂曉君

（1.湖北省仙桃市第一人民醫(yī)院，湖北 仙桃 433000；2.湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院，湖北 武漢 430075）

酒精性肝病初期表現(xiàn)為肝臟脂肪變性、進(jìn)而發(fā)展為肝纖維化、肝硬化[1]。三七護(hù)肝膠囊主要成分為三七、西洋參、葛根。研究表明，三七具有止血活血、利膽退黃、降酶、抗纖維化等作用[2-3]。西洋參總皂苷具有抗氧化、保護(hù)肝損傷作用[4]。葛根具有解肌退熱、生津止渴、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒的功效[5]。本研究以50%乙醇復(fù)制小鼠急性酒精性肝損傷模型，觀察三七護(hù)肝膠囊對酒精性肝損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制是否與抗氧化作用有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑

三七護(hù)肝膠囊（北京海德潤制藥有限公司，批號：20141207），無水乙醇（北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20140928），丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號：20150826）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（ 批 號：20150826）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）試劑盒（批號：20150825）購自南京建成生物工程研究所，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT）試劑盒（批號：140115002）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）試劑盒（批號：140215011）、 三酰甘油（Triglycerides，TG）試劑盒（批號：141714007）購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 實驗動物

昆明種小鼠，50只，雄性，SPF 級，體重（20±2）g，購自武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2012-0003。動物飼養(yǎng)于湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院屏障環(huán)境，5只/籠，12 h晝/夜循環(huán)照明，溫度20～26℃，相對濕度為40%～70%。飼料由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供，飼料生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2011-0011。實驗動物使用許可證號：SYXK（鄂）2014-0009。

1.3 實驗儀器

ML303型電子天平、XS6001S動物秤購自瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司，T18basic 勻漿儀（德國IKA公司），AU400全自動生化儀、BX41顯微鏡購自日本Olympus公司，3K15臺式冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司），TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），HM525冷凍切片機(jī)（美國賽默飛公司）。

1.4 方法

動物按體重隨機(jī)分為5組：空白對照組、模型對照組，以及三七護(hù)肝膠囊高、中、低劑量組，每組10只。用蒸餾水配制成67.5、45.0和22.5 mg/ml的三七護(hù)肝膠囊混懸液，灌胃體積為20 ml/kg。三七護(hù)肝膠囊高、中、低劑量組分別為1.35、0.90和0.45 g/kg，相當(dāng)于人用量的30、20和10倍?？瞻讓φ战M和模型對照組給予等體積蒸餾水灌胃。灌胃1次/d，并觀察動物一般狀況，稱重1次/周，并按動物體重調(diào)整灌胃量。給藥30 d后，除空白對照組外，其余4組一次灌胃50%乙醇（10 ml/kg）復(fù)制急性酒精性肝損傷模型[6]。模型復(fù)制后禁食16 h，以備檢測。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 血清生化指標(biāo) 小鼠摘眼球取血，常溫靜置后待其凝固，2 500 r/min離心10 min，測定血清中ALT、AST含量。

1.5.2 肝勻漿生化指標(biāo) 取血后立即頸椎脫臼處死動物，取肝臟稱重剪碎，按1∶9的比例加入生理鹽水，在冰浴中制成10%的勻漿，參照試劑盒說明書檢測肝勻漿中MDA、SOD、GSH、TG的含量。

1.5.3 肝組織病理學(xué)檢查 另取肝左葉，冷凍切片，油紅O染色，鏡下觀察脂滴在肝臟中的分布、范圍和面積。每例動物肝組織用40倍物鏡連續(xù)觀察組織切片，從肝臟的一端視野開始記錄細(xì)胞的病理變化，根據(jù)陽性細(xì)胞的多少和分布范圍，進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：肝細(xì)胞內(nèi)脂滴散在，稀少為0分；含脂滴的肝細(xì)胞≤1/4為1分；含脂滴的肝細(xì)胞≤1/2為2分；含脂滴的肝細(xì)胞≤3/4為3分；肝組織幾乎被脂滴替代為4分。將所得分?jǐn)?shù)的平均值作為該例肝組織的脂肪染色評分。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析或單因素方差分析，兩兩比較用Dunnett-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

實驗期間各組動物一般狀況良好，精神、毛發(fā)、活動、飲食、大小便正常?？瞻讓φ战M、模型對照組，以及三七護(hù)肝膠囊高、中、低劑量組在第0、1、2、3、4周的體重比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點(diǎn)的體重有差別（F=653.143，P=0.000），第4周＞第3周＞第2周＞第1周＞第0周，呈增長趨勢。②5組的體重?zé)o差別（F=1.011，P=0.412）。③5組的體重變化趨勢無差別（F=1.410，P=0.246）。見表1和圖1。

2.2 三七護(hù)肝膠囊對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

2.2.1 ALT 空白對照組、模型對照組，以及三七護(hù)肝膠囊高、中、低劑量組小鼠血清ALT含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)Dunnett-t檢驗，模型對照組小鼠血清ALT含量較空白對照組升高（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊高、中劑量組小鼠血清ALT含量較模型對照組降低（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊低劑量組小鼠血清ALT含量與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2.2 AST 空白對照組、模型對照組，以及三七護(hù)肝膠囊高、中、低劑量組小鼠血清AST含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)Dunnett-t檢驗，模型對照組小鼠血清AST含量較空白對照組升高（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊高、中劑量組小鼠血清AST含量較模型對照組降低（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊低劑量組小鼠血清AST含量與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三七護(hù)肝膠囊高、中劑量組可降低小鼠血清ALT、AST含量，對小鼠酒精性肝損傷有一定保護(hù)作用。見表2。

2.3 三七護(hù)肝膠囊對小鼠肝勻漿生化指標(biāo)的影響

2.3.1 MDA 空白對照組、模型對照組，以及三七護(hù)肝膠囊高、中、低劑量組小鼠小鼠肝勻漿中MDA含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)Dunnett-t檢驗，模型對照組小鼠肝勻漿中MDA含量較空白對照組升高（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊高、中劑量組小鼠肝勻漿中MDA含量較模型對照組降低（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊低劑量組小鼠肝勻漿中MDA含量與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.3.2 SOD 空白對照組、模型對照組，以及三七護(hù)肝膠囊高、中、低劑量組小鼠小鼠肝勻漿中SOD含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)Dunnett-t檢驗，模型對照組小鼠肝勻漿中SOD含量較空白對照組降低（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊高劑量組小鼠肝勻漿中SOD含量較模型對照組升高（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊中、低劑量組小鼠肝勻漿中SOD含量與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.3.3 GSH 空白對照組、模型對照組，以及三七護(hù)肝膠囊高、中、低劑量組小鼠小鼠肝勻漿中GSH含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)Dunnett-t檢驗，模型對照組小鼠肝勻漿中GSH含量較空白對照組降低（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊高劑量組小鼠肝勻漿中GSH含量較模型對照組升高（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊中、低劑量組小鼠肝勻漿中GSH含量與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表1 三七護(hù)肝膠囊對小鼠體重的影響 （n =10，g，±s）

表1 三七護(hù)肝膠囊對小鼠體重的影響 （n =10，g，±s）

組別 第0周 第1周 第2周 第3周 第4周空白對照組 19.7±0.7 30.1±2.3 34.9±2.6 37.1±2.9 39.7±2.5模型對照組 19.6±0.8 30.4±1.2 36.2±1.3 38.4±1.9 40.7±2.7三七護(hù)肝膠囊高劑量組 19.6±0.9 29.5±1.9 34.1±2.2 35.9±2.4 38.6±2.5三七護(hù)肝膠囊中劑量組 19.6±0.8 30.1±1.4 35.6±2.4 37.5±2.8 41.0±3.6三七護(hù)肝膠囊低劑量組 19.6±0.8 30.1±1.9 34.6±2.7 36.8±3.1 39.3±3.1

圖1 各組小鼠不同時間點(diǎn)體重變化趨勢

表2 各組小鼠血清ALT、AST含量比較（n =10，u/L，±s）

表2 各組小鼠血清ALT、AST含量比較（n =10，u/L，±s）

組別 ALT AST空白對照組 34.2±7.4 113.6±29.7模型對照組 75.3±10.8 358.9±33.9三七護(hù)肝膠囊高劑量組 43.1±7.3 171.2±18.6三七護(hù)肝膠囊中劑量組 52.1±7.9 212.3±22.3三七護(hù)肝膠囊低劑量組 70.4±11.6 332.1±31.7 F值 36.549 141.910 P值 0.000 0.000

2.3.4 TG 空白對照組、模型對照組，以及三七護(hù)肝膠囊高、中、低劑量組小鼠小鼠肝勻漿中TG含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)Dunnett-t檢驗，模型對照組小鼠肝勻漿中TG含量較空白對照組升高（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊高、中劑量組小鼠肝勻漿中TG含量較模型對照組降低（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊低劑量組小鼠肝勻漿中TG含量與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三七護(hù)肝膠囊高、中劑量組可降低小鼠肝勻漿中MDA、TG含量，三七護(hù)肝膠囊高劑量組可升高小鼠肝勻漿中SOD、GSH含量，對小鼠酒精性肝損傷有一定保護(hù)作用。見表3。

2.4 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果

空白對照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞條索排列整齊，肝細(xì)胞內(nèi)基本無脂滴，脂肪染色評分（0.78±0.42）分；模型對照組肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，肝組織幾乎被脂滴替代（染色后正常肝細(xì)胞為藍(lán)色，脂滴呈紅色），脂肪染色評分（3.20±0.62）分；三七護(hù)肝膠囊高、中、低劑量組肝細(xì)胞也發(fā)生不同程度的脂肪變性，脂肪染色評分分別為（2.52±0.76）、（2.56±0.75）和（2.88±0.91）分，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.459，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)Dunnett-t檢驗，模型對照組小鼠脂肪染色評分較空白對照組升高（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊高劑量組小鼠脂肪染色評分較模型對照組降低（P＜0.05）；三七護(hù)肝膠囊中、低劑量組小鼠脂肪染色評分與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。三七護(hù)肝膠囊高劑量組可減輕小鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度，對小鼠酒精性肝損傷有一定保護(hù)作用。見圖2。

表3 各組小鼠肝勻漿中MDA、SOD、GSH、TG含量比較 （n =10，±s）

表3 各組小鼠肝勻漿中MDA、SOD、GSH、TG含量比較 （n =10，±s）

組別 MDA/（nmol/mg） SOD/（u/mg） GSH/（mg/g） TG/（mmol/L）空白對照組 3.45±1.55 145.88±19.39 8.22±1.92 2.01±0.95模型對照組 6.03±1.56 80.02±12.73 6.18±1.46 3.07±0.87三七護(hù)肝膠囊高劑量組 3.81±0.94 123.32±14.98 8.31±1.90 2.02±0.50三七護(hù)肝膠囊中劑量組 3.79±0.96 90.76±14.54 7.33±1.96 2.17±0.40三七護(hù)肝膠囊低劑量組 5.45±1.75 87.56±13.92 7.39±1.45 2.71±0.84 F值 6.833 33.575 2.266 4.028 P值 0.000 0.000 0.048 0.007

圖2 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果 （油紅O染色×200）

3 討論

目前，酒精性肝病成為僅次于病毒性肝炎的第二大類肝臟疾病[6-7]，長期大量飲酒可使乙醇在體內(nèi)慢性蓄積，引起機(jī)體內(nèi)ALT、AST、TG、MDA等血液生化指標(biāo)水平升高[8-9]。肝功能檢查項目中，轉(zhuǎn)氨酶升高是反映肝臟實質(zhì)性損害的重要指標(biāo)。ALT、AST主要存在于肝細(xì)胞的線粒體和胞漿內(nèi)，正常血清中含量極少。當(dāng)肝細(xì)胞損傷時，肝細(xì)胞內(nèi)ALT、AST釋放入血，血清中ALT、AST水平升高，因此血清ALT、AST是檢測肝細(xì)胞損傷較為敏感和有效的重要生化指標(biāo)[10]。酒精主要在肝臟代謝、降解，當(dāng)乙醇在機(jī)體內(nèi)大量蓄積時，在乙醇脫氫酶和氧化酶的催化作用下生成轉(zhuǎn)化為乙酸，從而抑制三羧酸循環(huán)，使肝細(xì)胞的脂肪氧化能力減弱，脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)堆積，肝組織TG指標(biāo)升高。同時乙醇在肝細(xì)胞內(nèi)微粒體氧化系統(tǒng)作用下產(chǎn)生氧自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，影響肝細(xì)胞功能。MDA是不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)生成的終末產(chǎn)物之一，其含量可以間接反映膜脂質(zhì)氧化的受損程度[11]。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶，可以對抗與阻斷氧自由基對細(xì)胞造成的損害，并及時修復(fù)受損細(xì)胞。其水平的高低是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要指標(biāo)[12]。GSH是體內(nèi)中重要的抗氧化劑和自由基清除劑，是一種小分子肽。其作為谷胱甘肽過氧化物酶的底物，在清除細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物中發(fā)揮抗氧化作用。乙醇在肝臟代謝時產(chǎn)生大量氧自由基，消耗眾多的還原性保護(hù)物質(zhì)，如GSH。GSH水平下降，引起肝細(xì)胞變性和壞死；GSH水平升高提示機(jī)體抗氧化能力下降[12]。因此，降低ALT、AST和TG含量，減少脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)清除氧自由基能力可保護(hù)受損肝細(xì)胞，緩解繼發(fā)性肝功能下降。

本研究結(jié)果顯示，模型對照組小鼠血清ALT、AST含量升高，肝勻漿中MDA含量升高、SOD活性降低、GSH含量降低、TG含量升高，肝細(xì)胞脂肪染色評分升高，說明模型復(fù)制成功。三七護(hù)肝膠囊是由三七、西洋參、葛根為主要成分組成的復(fù)方制劑。研究報道，三七可降低小鼠急性酒精性肝損傷血清ALT、AST活性[13]。西洋參能降低飲酒所導(dǎo)致的血清轉(zhuǎn)氨酶升高，抑制過氧化產(chǎn)物MDA產(chǎn)生[14]。葛根素可使肝組織SOD活性增高，MDA含量降低[15]。本實驗中，通過該3種藥材配伍，觀察其對急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn),高、中劑量三七護(hù)肝膠囊可降低血清ALT、AST含量和肝組織中TG含量，抑制脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)堆積，改善小鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度，對酒精性肝損傷具有較好的保護(hù)作用；同時，本實驗從抗氧化方面初步探討三七護(hù)肝膠囊保護(hù)酒精性肝損傷的作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量三七護(hù)肝膠囊可降低肝臟中脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物MDA的含量，升高肝臟中清除氧自由基的抗氧化酶SOD活性，增加肝組織中還原型保護(hù)物質(zhì)GSH的含量，提示其對酒精性肝損傷肝臟的保護(hù)作用可能與對抗肝臟自由基的脂質(zhì)過氧化有關(guān)。

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