脊髓缺血再灌注損傷對(duì)大鼠CaMKIV基因及蛋白表達(dá)的影響*

陳忠婧，仝淞銘，蘇瑞超，葛禮豪，曹陽(yáng)，于德水

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2. 江蘇省徐州市腫瘤醫(yī)院 骨科，江蘇 徐州221000；3.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科，遼寧 錦州 121001）

脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord ischemiareperfusion injury，SCII）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，SCII后的病理生理過(guò)程非常復(fù)雜，主要包括自由基損傷、鈣通道開(kāi)放、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，往往對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成非常嚴(yán)重的損傷，也成為后期恢復(fù)的障礙[1-2]。鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶4（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV，CaMKIV）是細(xì)胞鈣通道開(kāi)放后被激活的一種蛋白激酶，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其在激活細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要作用，還可通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），在神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（Long-term potentiation，LTP）過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-5]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制SCII模型，觀察SCII后不同時(shí)間CaMKIV基因和蛋白的表達(dá)，探討其在SCII病理變化中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

兔抗CaMKIV（北京博奧森公司），免疫組織化學(xué)法試劑盒和DBA購(gòu)自北京中杉公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司、大連寶生生物技術(shù)有限公司。CaMKIV引物合成由日本TaKaRa公司、大連寶生生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

健康成年SD雄性大鼠84只，體重（250±20）g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物隨機(jī)分為7組，分別為假手術(shù)組、SCII 0 d組、SCII 1 d組、SCII 3 d組、SCII 7 d組、SCII 14 d組、SCII 28 d組，每組12只。

1.3 SCII模型的復(fù)制

采用Naslund腹主動(dòng)脈阻斷方法復(fù)制SCII模型。10%水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉后取仰臥位，無(wú)菌條件下行腹部旁正中切口，暴露腹主動(dòng)脈，于左腎動(dòng)脈分叉下方約0.5 cm處放置動(dòng)脈夾，夾閉腹主動(dòng)脈，以阻斷下方動(dòng)脈無(wú)搏動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)。阻斷30 min后取出動(dòng)脈夾，腹腔臟器復(fù)位，逐層縫合。假手術(shù)組在同樣條件下手術(shù)，只暴露腹主動(dòng)脈。

1.4 方法

1.4.1 取材 隨機(jī)取出各組大鼠4只，麻醉滿意后心臟灌流，取出L2～L5節(jié)段脊髓組織，于4℃、4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)染色。取每組剩余大鼠8只，麻醉滿意后，迅速取出L2～L5節(jié)段脊髓，放入EP管中，-80℃凍存，用于Western blot和qRT-PCR檢測(cè)。

1.4.2 免疫組織化學(xué)法 按5μm厚度切片，常規(guī)脫蠟。按免疫組織化學(xué)法試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，兔抗CaMKIV以1∶100稀釋，DBA顯色。由不了解分組情況的觀察者用聚焦光學(xué)顯微鏡，在高倍鏡下（400倍）隨機(jī)選取不同部位的6個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4.3 Western blot檢測(cè) 取長(zhǎng)約5 mm脊髓節(jié)段，加入蛋白裂解液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量，取等量蛋白樣品，SD-PAGE電泳分離蛋白，采用半干法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，1% BSA封閉1 h，CaMKIV一抗（1∶300稀釋）4℃孵育過(guò)夜。TBST漂洗，兔抗IgG（1∶1 000）室溫孵育1 h，TBST漂洗，化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光、顯影。以目的條帶與內(nèi)參β-actin的吸光度（optical density，OD）值表示相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行半定量分析。

1.4.4 qRT-PCR Trizol法提取組織RNA，在10μl反應(yīng)體系中去除基因組DNA后，在20μl反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。反應(yīng)條件：37℃預(yù)反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s。CaMKIV mRNA正向引物：5’-AGAAATCAGCCTGGTTCTTGAGCT-3’，反向引物：5’-AACTGCCTCCAGGATCTGCTTC-3’。GAPDH 正向引物 ：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，反向引物：5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。將逆轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA樣本進(jìn)行10倍梯度稀釋，向PCR管中加入20μl Master Mix反應(yīng)液，以GAPDH為對(duì)照，進(jìn)行PCR反應(yīng)，每組重復(fù)3次。利用ABI7500 qRT-PCR系統(tǒng)，對(duì)CaMKIV基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用ABI7500分析軟件，分析目的基因擴(kuò)增曲線并繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以GAPDH為參照基因，檢測(cè)SCII組脊髓中CaMKIV基因的表達(dá)水平，以假手術(shù)組為校準(zhǔn)樣本，比較SCII組相對(duì)假手術(shù)組的表達(dá)差異，并用2-△△Ct法進(jìn)行分析。

1.4.5 BBB評(píng)分 采用BASSO等[6]提出的BBB評(píng)分體系，處死前對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定，總分0～21分，完全功能缺失為0分，完全正常鼠為21分，評(píng)價(jià)內(nèi)容主要包括大鼠后肢關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)、驅(qū)趕位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置等。評(píng)分者為3位熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的非本課題實(shí)驗(yàn)人員，評(píng)分后取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差分析，方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組脊髓組織CaMKIV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

假手術(shù)組CaMKIV蛋白表達(dá)很少；SCII組CaMKIV蛋白高表達(dá)于神經(jīng)元胞漿、胞核及軸突，其細(xì)胞呈卵圓形或三角形，于脊髓前角和中央帶相對(duì)較多。在SCII 0 d，有少量陽(yáng)性神經(jīng)元散在分布于脊髓前角和中央帶；SCII 3 d，脊髓前角、中間帶及后角陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目增多且著色更深；然后隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少；至28 d，CaMKIV陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)減少，且著色更淺。除SCII 28 d組外，其余各組脊髓組織CaMKIV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=100.144，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，SCII 0 d組CaMKIV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于假手術(shù)組（P＜0.05）。隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，CaMKIV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)開(kāi)始增加，3 d時(shí)達(dá)高峰后逐漸下降，至14 d時(shí)仍高于假手術(shù)組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、2。

2.2 各組脊髓組織CaMKIV蛋白表達(dá)水平比較

除28 d組外，其余各組脊髓組織CaMKIV蛋白表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=46.598，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，SCII 0 d組CaMKIV蛋白表達(dá)量高于假手術(shù)組（P＜0.05）。隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸增多，3 d時(shí)達(dá)高峰，其后隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，至14 d時(shí)，SCII 14 d組CaMKIV蛋白表達(dá)量仍高于假手術(shù)組（P＜0.05），至28 d時(shí)，CaMKIV蛋白表達(dá)量與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3、4。

2.3 各組脊髓組織CaMKIV基因表達(dá)水平比較

圖1 大鼠脊髓組織CaMKIV陽(yáng)性表達(dá) （免疫組織化學(xué)法×400）

假手術(shù)組、SCII 0 d組、SCII 1 d組、SCII 3 d組、SCII 7 d組、SCII 14 d組、SCII 28 d組脊髓組織CaMKIV基因相對(duì)表達(dá)量分別為（1.000±0.00）、（1.228±0.135）、（1.674±0.209）、（1.863±0.216）、（1.402±0.093）、（1.258±0.119）和（1.135±0.084），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=88.057，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，SCII 0 d組CaMKIV相對(duì)表達(dá)量高于假手術(shù)組（P＜0.05）。隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，CaMKIV基因表達(dá)量開(kāi)始增加，3 d時(shí)達(dá)高峰，然后逐漸下降，28 d后趨于穩(wěn)定，且高于假手術(shù)組（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖2 各組大鼠脊髓組織CaMKIV陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（n =12，±s）

圖3 各組大鼠脊髓組織CaMKIV蛋白表達(dá)

圖4 各組大鼠脊髓組織CaMKIV蛋白表達(dá)水平比較（n =12，±s）

2.4 BBB評(píng)分

假手術(shù)組大鼠后肢功能正常，BBB評(píng)分21分，各組大鼠后肢功能評(píng)分比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=513.61，P=0.000）。SCII組術(shù)后即出現(xiàn)BBB評(píng)分下降，隨著時(shí)間推移，BBB評(píng)分逐漸升高，后肢功能有所恢復(fù)，至28 d處死時(shí)，BBB評(píng)分仍低于假手術(shù)組（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖5 各組大鼠脊髓組織CaMKIV基因表達(dá)水平比較（n =12，±s）

圖6 各組大鼠后肢功能評(píng)分 （n =12，±s）

3 討論

有關(guān)Ca2+及其作用的報(bào)道很多，Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在細(xì)胞內(nèi)信息的傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。鈣調(diào)蛋白（Calmodulin ，CaM）作為鈣離子結(jié)合蛋白，其活性受Ca2+濃度的調(diào)控。當(dāng)細(xì)胞受到傷害性刺激時(shí)，鈣離子內(nèi)流，造成細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載。當(dāng)細(xì)胞液內(nèi)Ca2+濃度升高到一定值時(shí)，CaM與Ca2+結(jié)合成Ca2+-CaM復(fù)合物，引起CaM構(gòu)象變化。該復(fù)合物激活CaMK，使許多靶蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，改變這些蛋白活性[8-9]。大量研究表明，鈣離子信號(hào)通過(guò)CaM和CaMK家族（CaMKI、CaMKII、CaMKIV）正向或負(fù)向調(diào)節(jié)突觸的復(fù)雜性，CaMKIV作為多功能CaMK家族的成員之一，可磷酸化主要轉(zhuǎn)錄因子CREB，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[4]。有報(bào)道認(rèn)為，Ca2+可通過(guò)調(diào)節(jié)CaMKIV激活轉(zhuǎn)錄因子CREB，從而介導(dǎo)樹(shù)突的生長(zhǎng)[10]。NAGENDRAN等[11]發(fā)現(xiàn)，CaMKIV是通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)突的分支和伸長(zhǎng)等具體形態(tài)特征，來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹(shù)突的復(fù)雜性，從而調(diào)控神經(jīng)元樹(shù)突的生長(zhǎng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用。

關(guān)于CaMKIV在SCII中的作用，目前的文獻(xiàn)報(bào)道較少。因其廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。RIBAR等[12]發(fā)現(xiàn)，CaMKIV基因敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能損害，他提出CaMKIV在維持小腦的功能中發(fā)揮重要作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，CaMKIV通過(guò)誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元中鉀的丟失來(lái)抑制凋亡，從而起到保護(hù)神經(jīng)的作用[13]。SCII后，鈣信號(hào)通過(guò)細(xì)胞體進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致核活化，CaMKIV作為CaMK通路中的核效應(yīng)器，協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。而HARRISON等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CaMKIV在一些神經(jīng)元亞種群的細(xì)胞質(zhì)和軸突中也有表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)CaMKIV蛋白進(jìn)行初步細(xì)胞定位，結(jié)果顯示CaMKIV蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿及細(xì)胞核中，說(shuō)明CaMKIV參與脊髓損傷后神經(jīng)元的病理變化，且作用部位為細(xì)胞漿及細(xì)胞核。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qRT-PCR對(duì)假手術(shù)組及SCII組CaMKIV基因表達(dá)的時(shí)間變化進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SCII組CaMKIV基因表達(dá)相對(duì)假手術(shù)組升高，提示SCII后可快速誘導(dǎo)CaMKIV基因轉(zhuǎn)錄，并促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。并通過(guò)Western blot及免疫組織化學(xué)法對(duì)CaMKIV蛋白表達(dá)的時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SCII可導(dǎo)致脊髓CaMKIV蛋白表達(dá)發(fā)生變化，呈先短暫升高，在3 d時(shí)達(dá)高峰后逐漸降低的趨勢(shì)。結(jié)果顯示，在SCII后不同時(shí)間，因脊髓損傷程度不同，CaMKIV蛋白表達(dá)也隨之發(fā)生變化，說(shuō)明CaMKIV在損傷的脊髓中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)僅證實(shí)，CaMKIV在SCII中的時(shí)序性表達(dá)，其參與SCII的病理變化，但具體機(jī)制尚不十分清楚。TOYODA等[4]研究表明，在CaMKIV過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠中，大腦前扣帶回LTP增強(qiáng)，其通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成來(lái)增強(qiáng)LTP過(guò)程。而KOKUBO等[15]在小鼠小腦顆粒神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，CaMKIV的缺失會(huì)導(dǎo)致BDNF基因和蛋白表達(dá)降低。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CaMKIV可能通過(guò)調(diào)節(jié)BDNF來(lái)發(fā)揮作用。

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