芒果苷的分離純化及鑒定研究

鄧紅梅，陳奕君，林壯輝，鄭理文，孫澤峰，郭偉峰

（廣東石油化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，廣東茂名 525000）

藥理研究試驗表明，芒果苷不僅具有化痰、止咳、平喘、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫等功效，還對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有興奮和保護作用，并且能增強心肌收縮功能，保肝利膽[1-4]。芒果皮是芒果生產(chǎn)加工中的主要副產(chǎn)物之一，基本上沒有被很好地利用而是被大量廢棄，不僅污染環(huán)境而且造成資源浪費。芒果皮中富含芒果苷，目前從芒果葉中提取芒果苷的研究較多[5-7]，而對于芒果皮中芒果苷的研究卻很少。試驗利用索氏提取法從芒果皮和芒果葉中分離純化芒果苷，并利用紫外分光光度法對提取的芒果苷進行定量分析。此外，根據(jù)芒果苷的含量利用D101，AB-8，NKA 9型這3種大孔樹脂對其純化效果進行比較。最終利用薄層層析對純化的芒果苷進行定性分析。為芒果皮和芒果葉的開發(fā)利用提供有效途徑，同時也為芒果資源的綜合利用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

金煌芒果，購于當(dāng)?shù)爻校幻⒐麡淙~采摘自校園內(nèi)，洗凈烘干，剪碎備用。

試劑：芒果苷標(biāo)準(zhǔn)對照品，購于上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲酸、甲醇、磷酸，均為分析純；D101型大孔樹脂、NKA 9型大孔樹脂，購于天津市光復(fù)精細化工研究所；AB-8型大孔樹脂，購于上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；硅膠GF 254板，購于青島海洋化工廠分廠。

主要儀器：RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；UV-5100 B型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；JJ 224 BC型分析天平，常熟市雙杰測試儀器廠產(chǎn)品；WD-9413 A型凝膠成像儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 芒果苷提取

分別準(zhǔn)確稱取10.0 g處理好的芒果皮和葉，分別置于索氏提取器中，按照料液比為1∶10加入70%乙醇加熱提取1.5 h，重復(fù)提取3次，過濾并合并濾液，濃縮濾液至100 mL。分別將2種濃縮液置于分液漏斗中，加入100 mL石油醚，振蕩、靜置萃取，倒出石油醚層，反復(fù)萃取直至石油醚層無色，棄石油醚層，最后將水層濃縮得到40 mL芒果苷濃縮液。分別精確量取芒果皮和葉濃縮液各1 mL，分別置于100 mL容量瓶，加入50%乙醇定容，搖勻。即得到2種芒果苷樣品溶液。

1.2.2 芒果苷含量的測定

（1） 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。參照文獻[8]略有改變，配制成12.06 μg/mL芒果苷標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，準(zhǔn)確取芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品儲備液10.0 mL，用50%乙醇定容至100.0 mL，搖勻；分別準(zhǔn)確移取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 mL，用 50%乙醇定容至10.0 mL， 即 獲 得 4.020， 8.040， 12.060， 16.080，

20.100 ，24.120，28.140，32.160，36.180 μg/mL 的芒果苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后以50%乙醇作為參照，于波長258 nm處測定吸光度，以吸光度對濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行線性回歸分析。

（2）檢驗精密度。分別準(zhǔn)確吸取6份1 mL的芒果皮芒果苷樣品溶液，置于10 mL帶塞比色管中，加入50%乙醇至10 mL。于波長258 nm處測定吸光度，計算出芒果苷含量。

（3） 檢驗重復(fù)性。分別量取芒果皮和葉2種芒果苷樣品溶液，于波長258 nm處測其吸光度，每份樣品測定5次，觀察各種樣品的測定結(jié)果是否一致。

（4） 檢驗穩(wěn)定性。取芒果皮和葉2種芒果苷樣品溶液置于室溫下，每隔15 min取樣測定其吸光度，分別測9次，觀察溶液中芒果苷是否保持穩(wěn)定，從而確定其有效測定時間范圍。

1.2.3 不同大孔樹脂對芒果苷純化效果的研究

（1） 大孔樹脂的預(yù)處理。分別稱取一定量的D101，AB-8，NKA 9型樹脂，用0.5 BV的乙醇浸泡24 h，用2 BV的乙醇以2 BV/h流速通過樹脂柱，并浸泡4～5 h，再用水以同樣流速洗凈，用乙醇洗至流出液加水不呈白色混濁為止，用2 BV的5%HCl溶液以4～6 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡樹脂2～4 h。而后用水以同樣流速洗至出水pH值為中性，用2 BV的2%NaOH溶液以4～6 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡樹脂2～4 h，而后用水以同樣流速洗至出水pH值呈中性。

（2） 不同大孔樹脂對芒果苷靜態(tài)吸附的測定。量取3種經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂（D101，AB-8，NKA9型）各5 g，分別置于3個錐形瓶中，取150 mL芒果皮芒果苷提取液，平均加入各個錐形瓶中振蕩吸附24 h，充分吸附后，過濾，分別取3種樹脂的濾液1 mL，進行吸光度的分析，測定濾液剩余芒果苷的含量（芒果葉芒果苷提取液做法一樣）。按下列公式計算各樹脂在室溫下的吸附量和吸附率。

式中：C0——吸附前溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；Ce——吸附后溶液質(zhì)量濃度，mg/mL。

式中：Q——吸附量，mg/g；

W——干樹脂質(zhì)量，g；

V——溶液體積，mL。

用70%的乙醇沖洗樹脂，至乙醇洗脫液無色為止，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至50 mL。測定其中芒果苷的含量，根據(jù)下式計算各樹脂在室溫下的解析率。

式中：C0——吸附前溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；

C1——吸附后溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；

V1——上樣溶液的體積，mL；

C2——解析液質(zhì)量濃度，mg/mL；

V2——解析液體積，mL。

1.2.4 最佳樹脂對芒果苷動態(tài)吸附的測定

（1） 吸附階段的考查。精確吸取5.0 mL芒果皮芒果苷濃縮液于500 mL容量瓶中，加50%乙醇定容、搖勻。

取由1.2.3項下篩選出的最適大孔樹脂30.0 mL，濕法裝柱。緩慢加入芒果苷提取液350.0 mL，以4 BV/h的流速通過樹脂柱，每10.0 mL收集1管，共收集30管，分別測定流出液中芒果苷的濃度，繪制吸附曲線，找出該大孔樹脂的泄漏點和飽和點。

（2） 解析階段的考查。用2～4 BV的蒸餾水流速上述樹脂，直至流出液無色為止；依次用10.0%，30.0%，50.0%，70.0%，90.0%乙醇溶液各4.0 mL對樹脂進行梯度洗脫，每10.0 mL收集1管，共收集20管。分別測定各管收集液的芒果苷濃度，繪制解析曲線，找出解析芒果苷的最適乙醇體積分數(shù)。

1.2.5 純化后的芒果苷檢驗

（1）芒果苷樣品溶液的制備。分別精密量取經(jīng)大孔樹脂純化后的芒果皮和葉濃縮液各1.0 mL，分別置于具塞比色管中，加入50.0%乙醇10.0 mL，作為供試液。

另外，取芒果苷標(biāo)準(zhǔn)對照品，加50.0%乙醇制成0.10 mg/mL溶液，作為對照品溶液。

（2） 薄層層析法（TLC） 檢測。①畫線：用2B以上的鉛筆在距硅膠G板下端至少5 mm處畫一條線，即點樣線；在距硅膠G板上端5 mm處畫一條線，為前沿線。畫線時要輕而清晰，在點樣線上畫上豎線形成十字型，用以確定點樣位置，2個點樣點之間距離一致。②點樣：用毛細管分別吸取芒果苷標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液、芒果皮和芒果葉樣品溶液，從左往右分別點在硅膠G板上的各個點樣點。③展開：以乙酸乙酯-甲酸-甲醇-水（10∶1∶1∶1） 為展開劑，將點好樣的硅膠板置于層析缸中展開。當(dāng)展開液展開至接近前沿線時，取出、晾干。④顯色：噴以10.0%的硫酸乙醇溶液，晾干，在105℃下加熱烘干至顯現(xiàn)淡黃色斑點，置于365 nm紫外燈下檢視。

2 結(jié)果分析

2.1 芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性考查結(jié)果

根據(jù)芒果苷標(biāo)準(zhǔn)對照品的測定方法，測定不同質(zhì)量濃度芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長258 nm處的吸光度，以芒果苷的質(zhì)量濃度對吸光度繪制芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程：Y=0.069 3X-0.036 3，R2=0.999。

芒果苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 芒果苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可以看出，芒果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線在4.020～36.180 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.2 精密度檢驗結(jié)果分析

芒果皮芒果苷含量精密度試驗結(jié)果見表1。

表1 芒果皮芒果苷含量精密度試驗結(jié)果

表1為在258nm波長處測定芒果皮中芒果苷樣品精密度檢驗結(jié)果。結(jié)果表明，用紫外分光光度法測定的芒果皮中芒果苷含量變化不大。因此，用紫外分光光度法測定芒果苷含量不僅具有可行性，還具有簡便性。

2.3 重復(fù)性檢驗結(jié)果分析

芒果皮芒果苷含量重復(fù)性試驗結(jié)果見表2。

表2 芒果皮芒果苷含量重復(fù)性試驗結(jié)果

表2為芒果皮和芒果葉的芒果苷樣品在258 nm波長處測定芒果苷含量的重復(fù)性檢驗的結(jié)果，每份供試品測定5次（n=5)。從表2可知，芒果皮的RSD為0.89%，芒果葉的RSD為1.31%，二者的RSD均小于2.00%，一致性程度較高，表明了用紫外分光光度法測定芒果苷含量的方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性比較好。

2.4 穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

芒果皮芒果苷含量精密度試驗結(jié)果見表3。

表3 芒果皮芒果苷含量精密度試驗結(jié)果

表3為芒果皮和葉2種芒果苷樣品在258 nm波長處每隔15 min測定一次芒果苷含量的結(jié)果。從表3可知，2種芒果苷樣品溶液于室溫下存放2 h內(nèi)，同質(zhì)量濃度的芒果苷供試品的吸光度變化不明顯，2種芒果苷樣品溶液RSD均在小于2.00%，表明紫外分光光度法在2 h內(nèi)測定芒果苷的穩(wěn)定性較好。因此，該試驗表明用紫外分光光度計測定樣品中芒果苷含量是可行的。

2.5 不同型號大孔樹脂對芒果苷靜態(tài)吸附的結(jié)果

不同型號的大孔樹脂靜態(tài)吸附與解析效果見表4。

表4 不同型號的大孔樹脂靜態(tài)吸附與解析效果

表4為不同大孔樹脂采用靜態(tài)吸附法吸附芒果皮芒果苷，通過測定吸附殘留液和解析液中芒果苷含量來研究其靜態(tài)吸附和解析效果。由表4可知，D101型大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解析效果最佳，AB-8型大孔樹脂次之，NKA 9型相對來說較弱。

芒果苷是一種四羥基吡酮的碳酮苷，屬雙苯吡酮類黃酮類化合物，不溶于非極性溶劑，略溶于甲醇、乙醇、水等。所以，芒果苷具有一定的弱極性和非極性，適合于D101型這類非極性樹脂和AB-8型這類弱極性樹脂。此外，芒果苷的分子量為422.33，而D101型大孔樹脂（孔徑為10 nm） 的孔徑比AB-8型（孔徑為13～14 nm） 和NKA 9型（孔徑為15.5～16.5 nm）都小，因此D101型大孔樹脂對芒果苷的吸附能力優(yōu)于AB-8型和NKA 9型大孔樹脂。

2.6 D101型大孔樹脂對芒果苷動態(tài)吸附的測定

D101型大孔樹脂對芒果苷的動態(tài)吸附曲線見圖2，D101型大孔樹脂對芒果苷的動態(tài)解析曲線見圖3。

圖2 D101型大孔樹脂對芒果苷的動態(tài)吸附曲線

圖3 D101大孔樹脂對芒果苷的動態(tài)解析曲線

由圖2可知，從第9份流出液開始，芒果苷出現(xiàn)了較大的泄漏，隨著流出液份數(shù)增大，芒果苷含量也逐漸增多，從第25份流出液開始芒果苷動態(tài)吸附趨于飽和。

由圖3可知，10%乙醇洗脫效果最差，用70%乙醇解析液中芒果苷含量最高。說明70%乙醇是最適洗脫濃度。

大孔樹脂的吸附作用主要是化合物分子與樹脂之間產(chǎn)生的范德華力或氫鍵而達到的。因此，可以根據(jù)有機化合物吸附力及其分子量大小使用一定濃度的溶劑進行洗脫，從而達到分離、純化、除雜、濃縮等目的。隨著乙醇體積分數(shù)的增大，一方面可以提高待分離有機物的溶解度和樹脂的溶脹；另一方面乙醇能誘導(dǎo)非極性溶劑分子產(chǎn)生一定的極性，根據(jù)相似相溶原理，從而使極性與非極性溶液互溶。但是，由于芒果苷微溶于乙醇，溶于熱稀乙醇，所以當(dāng)乙醇體積分數(shù)超過90%時，芒果苷的溶解度反而減少，從而導(dǎo)致芒果苷洗脫效果不明顯。

不同體積分數(shù)乙醇解析液中芒果苷含量比較見表5。

由表5可知，當(dāng)洗脫劑乙醇的體積分數(shù)低于30%或高于90%時，洗脫效果不明顯，當(dāng)乙醇的體積分數(shù)為70%，洗脫效果最佳。由表5可知，芒果皮、芒果葉純化后的芒果苷含量分別是上樣前的1.43倍和1.51倍。

表5 不同體積分數(shù)乙醇解析液中芒果苷含量比較

通過D101、AB-8和NKA 9型大孔樹脂對芒果苷純化效果的分析，發(fā)現(xiàn)D101型大孔樹脂對芒果苷的富集純化要優(yōu)于其他2種大孔樹脂。這與李學(xué)堅等人的試驗結(jié)果相符合?；衔锏臉O性大小會直接影響大孔樹脂的分離純化效果。一般來說化合物極性較大的分子一般用中極性、極性的樹脂進行分離純化，而極性小的分子一般使用非極性樹脂進行分離純化。

2.7 芒果苷的薄層層析（TLC）鑒別結(jié)果

365 nm紫外光下芒果苷薄層色譜見圖4。

圖4 365 nm紫外光下芒果苷薄層色譜

由圖4可知，供試樣液與芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品在色譜的相應(yīng)位置上，顯現(xiàn)出相同顏色的淺藍色熒光斑點。經(jīng)過多次試驗，薄層色譜的重現(xiàn)性良好。

苷類的溶解性與苷元和糖的結(jié)構(gòu)均有關(guān)系。一般來說，苷元具有弱親水性，而糖具有親水性。苷類的極性、親水性往往與糖基有關(guān)，由于苷類這類物質(zhì)存在糖的多羥基結(jié)構(gòu)，而且苷元的活潑氫與糖的端基羥基結(jié)合，導(dǎo)致了苷元結(jié)構(gòu)影響變小。展開劑使用極性較大的有機溶劑，如氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇和水。乙酸和甲酸的使用，不僅能增大展開劑的極性，而且還能抑制硅膠羥基的作用，減少拖尾。如果提取物中含有色素或者大分子物質(zhì)時，展開后顯色經(jīng)常會出現(xiàn)拖尾或擴散，導(dǎo)致顯色后的熒光點不集中，甚至出現(xiàn)交聯(lián)。

3 結(jié)論

（1）用紫外分光光度法測定芒果苷含量時基本不會受到芒果皮或象牙芒葉提取物溶液中其他物質(zhì)的干擾，測定結(jié)果的準(zhǔn)確性較高、穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好，RSD均小于2.00%。同品種的芒果皮與芒果葉相比，芒果葉中的芒果苷含量多于芒果皮。

（2）D101型大孔樹脂對芒果苷的富集純化要優(yōu)于AB-8和NKA 9型大孔樹脂。70%乙醇的洗脫效果比較好，而且用70%乙醇洗脫解析液中芒果苷含量最高，分別是上柱前芒果皮、芒果葉樣液芒果苷含量的1.43倍，1.51倍，富集純化的效果明顯。

（3）純化后的芒果苷的薄層層析（TLC） 色譜帶與芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品相一致，在365 nm紫外光下顯現(xiàn)出相同顏色的淺藍色熒光斑點。

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