模擬手機(jī)電磁輻射系統(tǒng)對(duì)SD大鼠耳蝸邊緣細(xì)胞影響的研究*

張應(yīng)龍，左汶奇

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院耳鼻喉科，重慶 402160)

電磁輻射是繼空氣、水、食品污染后的第4大污染物。隨著社會(huì)的進(jìn)步，電子產(chǎn)品的使用大量增加，如微波爐、電腦、電磁爐等，人們暴露于電磁場(chǎng)的概率也隨之增高。手機(jī)是現(xiàn)代社會(huì)交流傳遞信息必不可少的工具，人們常常隨身攜帶。900、1 800 MHz是常用的兩種手機(jī)頻率，手機(jī)的輻射強(qiáng)度在每個(gè)國(guó)家有不同的規(guī)定，比如歐洲和美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)是小于1.6 w/kg，但4 w/kg常被用來了解手機(jī)輻射的熱效應(yīng)[1]。關(guān)于手機(jī)對(duì)人體的影響，目前有學(xué)者發(fā)現(xiàn)手機(jī)電磁輻射可以導(dǎo)致精子活力的下降、神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量及活力的降低，同時(shí)手機(jī)電磁輻射與神經(jīng)膠質(zhì)瘤和聽神經(jīng)瘤發(fā)病有相關(guān)性[2-4]。但有研究發(fā)現(xiàn)電磁輻射并不會(huì)引起明顯的生物學(xué)效應(yīng)，原因?yàn)殡姶泡椛洳煌陔婋x輻射，其能量低于電離輻射，電磁輻射對(duì)各器官的影響仍是目前研究的熱點(diǎn)[5]。雙耳是手機(jī)輻射的直接效應(yīng)器官，有研究發(fā)現(xiàn)幼鼠暴露于900 MHz手機(jī)電磁輻射裝置下，盡管聽力沒有改變，但耳蝸超微結(jié)構(gòu)有改變[6]；有離體研究發(fā)現(xiàn)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在經(jīng)過脂多糖處理后暴露于1 800 MHz、4 w/kg強(qiáng)度下，細(xì)胞有自噬小體生成，自噬蛋白LC3-Ⅱ和beclin1有陽性表達(dá)，證實(shí)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)有改變[7]；還有研究報(bào)道小鼠耳蝸毛細(xì)胞HEI-OC1暴露于1 760 MHz電磁輻射系統(tǒng)下，細(xì)胞周期、蛋白表達(dá)及DNA等均未見明顯異常[8]?；钚匝醮?ROS)系統(tǒng)的激活被認(rèn)為是電磁輻射產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的主要機(jī)制[9]，而耳蝸邊緣細(xì)胞對(duì)維持內(nèi)耳生理具有重要作用。因此，本課題組選擇耳蝸邊緣細(xì)胞作為模擬電磁輻射研究的效應(yīng)細(xì)胞，探討1 800 MHz輻射頻率、輻射強(qiáng)度比吸收率(SAR)在2、4 w/kg模式下，邊緣細(xì)胞DAN的損傷、細(xì)胞凋亡情況及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料來源 0～3 d SD大鼠的乳鼠(由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量約為5 g，雌雄不限。所有動(dòng)物均按照標(biāo)準(zhǔn)化流程飼養(yǎng)，并得到重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2邊緣細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定 SD大鼠乳鼠通過乙醚麻醉后，75%乙醇的容器浸泡10 min，充分消毒斷頭；在解剖顯微鏡下用顯微鑷去除顳骨聽泡骨殼后，用顯微鑷分離出耳蝸外側(cè)壁的基底回，將血管紋組織完全剝離，0.1%Ⅱ型膠原酶溶解，置于37 ℃孵箱中30 min；取出后離心，棄上清液，用1 mL MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液與之輕輕吹打混勻后，將細(xì)胞懸液置入無菌6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞在37 ℃、95%O2、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后可貼壁，倒置顯微鏡下可以觀察到邊緣細(xì)胞的典型形態(tài)。由于成纖維細(xì)胞貼壁較慢，隔天可用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕沖洗培養(yǎng)板底部能純化邊緣細(xì)胞。將純化后細(xì)胞懸液接種于盛有用多聚賴氨酸包被后的蓋玻片無菌6孔板，當(dāng)細(xì)胞單層生長(zhǎng)至蓋玻片的80%時(shí)，用免疫熒光染色方法檢測(cè)細(xì)胞角蛋白18(CK18)在該細(xì)胞中的表達(dá)。棄培養(yǎng)基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100穿透，5% 牛血清清蛋白(BSA)封閉，100 μL一抗(1∶50 稀釋)4 ℃孵育過夜；加入100 μL二抗(1∶100)，避光，孵箱中孵育30 min；DAPI工作液染色，抗熒光淬滅劑封片。

1.31 800 MHz輻射系統(tǒng) 該系統(tǒng)由4部分組成：高頻電磁發(fā)生器和頻帶放大器(購(gòu)自北京博倫銳科技公司)、計(jì)算機(jī)、放置于培養(yǎng)箱內(nèi)的兩個(gè)矩形電磁波導(dǎo)臺(tái)(放置35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿)。暴露程序所有數(shù)據(jù)均由計(jì)算機(jī)控制。可以隨機(jī)設(shè)置一個(gè)波導(dǎo)臺(tái)為暴露組，另一個(gè)波導(dǎo)臺(tái)自動(dòng)成為屏蔽組；也可以手動(dòng)設(shè)置暴露組。

1.4細(xì)胞暴露程序及分組 細(xì)胞暴露于1 800 MHz輻射系統(tǒng)下，SAR值選擇2、4 w/kg，時(shí)間是24 h，模式是開5 min，關(guān)10 min的手機(jī)通話模式。細(xì)胞分組：(1)對(duì)照組；(2)2 w/kg暴露組和屏蔽組；(3)4 w/kg暴露組和屏蔽組；(4)雙氧水陽性對(duì)照組。

1.5彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷 彗星實(shí)驗(yàn)是公認(rèn)的檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞核損傷的技術(shù)，具有較高的特異度和靈敏度[10]，具體方法是棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，胰酶消化，離心棄上清液。PBS重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)105/mL。彗星試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Trebigen公司)，低熔點(diǎn)瓊脂糖100 ℃融化后60 ℃水浴箱中備用。吸取10 μL細(xì)胞懸液加入60 μL瓊脂糖中反復(fù)吹打混勻，吸取含細(xì)胞懸液的瓊脂糖10 μL鋪板后在暗盒內(nèi)4 ℃冷卻30 min待膠凝固。將載玻片放置于4 ℃裂解液中裂解2 h，避光。將載玻片放置于電泳槽中，設(shè)置電壓25 V/300 mA，時(shí)間30 min。載玻片取出后蒸餾水清洗，75%、95%無水乙醇中分別脫水。載玻片4 ℃中干燥30 min。SYBR?Green 染色15 min。熒光顯微鏡拍照。CASP軟件分析。正常細(xì)胞無拖尾現(xiàn)象，而受損細(xì)胞的DNA表現(xiàn)為像彗星一樣的拖尾，細(xì)胞的頭部基本維持在原來的位置，尾部是損傷后從細(xì)胞核遷移的DNA片段，觀察DNA損傷的3個(gè)參數(shù)：尾部DNA水平、尾力距和尾長(zhǎng)。

1.6流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)電磁輻射對(duì)邊緣細(xì)胞凋亡水平的影響 將各組細(xì)胞分別重懸于200 μL 1×結(jié)合緩沖液中，控制細(xì)胞濃度在106～107個(gè)/毫升，并分別移入流式管中；每管加入5 μL的annexin V-FITC和10 μL的PI；避光，冰上孵育15 min；流式細(xì)胞儀上讀取每組10 000個(gè)細(xì)胞的凋亡率，計(jì)算出平均值。

1.7熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)ROS的生成 以雙氧水為陽性對(duì)照。按照1∶1 000用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA終濃度10 μmol/L。收集細(xì)胞后裝載探針。去除細(xì)胞培養(yǎng)液加入50 μL稀釋好DCFH-DA，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 min，以無血清培養(yǎng)基洗滌3次，每次5 min；收集細(xì)胞，在熒光酶標(biāo)儀中觀察細(xì)胞熒光值。激發(fā)波長(zhǎng)使用488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)使用525 nm。

2 結(jié) 果

2.1邊緣細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的大鼠邊緣細(xì)胞。未純化前的邊緣細(xì)胞與長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞一起貼壁生長(zhǎng)，邊緣細(xì)胞大小不一，呈多角形，細(xì)胞間境界清楚，顏色較暗。數(shù)個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)融合成單層時(shí)即呈典型的“鋪路石”特征。當(dāng)細(xì)胞堆積成多層時(shí)可形成“dome”結(jié)構(gòu)。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)邊緣細(xì)胞內(nèi)CK-18的表達(dá)，可見CK-18在邊緣細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高表達(dá)，呈綠色熒光。

2.2彗星實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選擇200個(gè)細(xì)胞作為結(jié)果分析，細(xì)胞拍攝時(shí)一般選擇200倍。分析軟件采用CASP Lab。雙氧水作為陽性對(duì)照，細(xì)胞有明顯的拖尾現(xiàn)象，結(jié)果顯示手機(jī)電磁輻射能量不足以引起邊緣細(xì)胞DNA的損傷。DNA損傷的3個(gè)參數(shù)與陽性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)電磁輻射對(duì)邊緣細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示雙氧水陽性對(duì)照組邊緣細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余各組同對(duì)照組邊緣細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞無明顯變化(P>0.05)，說明電磁輻射不會(huì)引起邊緣細(xì)胞凋亡率增加。見表2。

2.4電磁輻射對(duì)細(xì)胞ROS生成的影響 本實(shí)驗(yàn)采用DCFH-DA試劑盒檢測(cè)暴露于電磁輻射后細(xì)胞內(nèi)ROS變化情況，以雙氧水作為陽性對(duì)照。發(fā)現(xiàn)在4 w/kg輻射后ROS生成量和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。說明4 w/kg輻射強(qiáng)度下ROS生成量顯著增加。

表1 各組彗星實(shí)驗(yàn)參數(shù)數(shù)值

表2 細(xì)胞凋亡率和ROS生成量在各組中的表達(dá)情況

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討 論

離體和活體研究中已經(jīng)證實(shí)ROS的激活是手機(jī)電磁輻射產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的主要機(jī)制，過量產(chǎn)生的活性氧可以引起細(xì)胞不同程度的氧化應(yīng)激損傷[11]。耳蝸是保持著較高有氧代謝的器官，在產(chǎn)生ATP供應(yīng)能量的同時(shí)也能產(chǎn)生出大量ROS，因此極易遭到ROS的氧化攻擊。維持穩(wěn)定的耳蝸微電位對(duì)正常的聽力至關(guān)重要，而耳蝸微電位的維持則主要取決于耳蝸外側(cè)壁組織的泵機(jī)制。血管紋是位于耳蝸外側(cè)壁的重要組織結(jié)構(gòu)，它是由3類細(xì)胞構(gòu)成的特殊的含毛細(xì)血管的復(fù)層上皮，最外層是邊緣細(xì)胞，中間層是中間細(xì)胞，最內(nèi)層是基底細(xì)胞。而其中的邊緣細(xì)胞鄰近內(nèi)淋巴腔，其細(xì)胞膜上具有Na+-K+-ATP酶以及Na+/K+通道，對(duì)維持內(nèi)淋巴液離子環(huán)境以及耳蝸微電位具有重要意義[12]。一旦邊緣細(xì)胞受到ROS 的損害，會(huì)影響到內(nèi)耳的能量供應(yīng)。

本研究初期僅僅采用離體的短期暴露的方式研究手機(jī)電磁輻射對(duì)耳蝸邊緣細(xì)胞的影響，但手機(jī)電磁輻射對(duì)聽力系統(tǒng)的長(zhǎng)期影響仍需要在活體研究中進(jìn)一步證實(shí)。本研究中采用的手機(jī)通話模式，即開5 min關(guān)10 min暴露模式能更好地探討手機(jī)電磁輻射的生物學(xué)效應(yīng)，更能模擬手機(jī)電磁輻射對(duì)人體的影響。手機(jī)對(duì)SAR有明確的限制規(guī)定，各個(gè)國(guó)家規(guī)定和標(biāo)準(zhǔn)有所不同，但手機(jī)在接通瞬間或者信號(hào)不足的情況下輻射強(qiáng)度會(huì)較平常顯著增大，4 w/kg常常被用來作為電磁輻射熱效應(yīng)的研究，因此本課題組采用的2、4 w/kg輻射強(qiáng)度是合理的。本研究發(fā)現(xiàn)1 800 MHz手機(jī)電磁輻射不足以引起耳蝸邊緣細(xì)胞DNA的直接損傷，因?yàn)殡姶泡椛涞哪芰窟h(yuǎn)較電離輻射弱，但通過熒光探針發(fā)現(xiàn)了4 w/kg輻射強(qiáng)度下有ROS的激活，證實(shí)了ROS的激活是手機(jī)電磁輻射產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的主要機(jī)制，但生成的過量的ROS不足以引起邊緣細(xì)胞凋亡的增加和細(xì)胞DNA的損傷，認(rèn)為ROS盡管增加明顯，但尚在代償范圍之內(nèi)；連續(xù)暴露于電磁輻射下，ROS的生成量會(huì)逐漸增加，超過細(xì)胞和組織的代償能力后即會(huì)出現(xiàn)損傷。有研究認(rèn)為手機(jī)輻射產(chǎn)生的過量的ROS可以引起細(xì)胞DNA損傷，Ca2+通道激活，以及熱休克蛋白表達(dá)增加，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)明顯的損傷，考慮不同組織和細(xì)胞對(duì)電磁輻射有不同的敏感性[13-14]。本課題組擬進(jìn)一步通過動(dòng)物模型驗(yàn)證手機(jī)電磁輻射的長(zhǎng)期累積效應(yīng)。

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