特應(yīng)性皮炎轉(zhuǎn)錄組學及靶點治療研究進展

陳麗潔 梁景耀 劉玉梅 邵蕾 王建琴

510095廣州醫(yī)科大學皮膚病研究所 廣州市皮膚病防治所

隨著基因研究的不斷發(fā)展，曾經(jīng)耳熟能詳?shù)闹行姆▌t“DNA?mRNA-蛋白質(zhì)”模式已經(jīng)無法解釋許多復雜的生命過程，從全基因組層面研究各種生理病理過程是目前重要的研究方向之一。全方位對疾病的研究包括，基因組水平、轉(zhuǎn)錄組水平、蛋白質(zhì)組水平等，其中轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）指特定生物體在某種狀態(tài)下所有基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和。在轉(zhuǎn)錄組中包含已熟知編碼蛋白的信使RNA（mRNA），也包括近年來新發(fā)現(xiàn)的不編碼蛋白的MicroRNA、長鏈非編碼lncRNA等非編碼RNA，這些轉(zhuǎn)錄組RNA彼此協(xié)同作用共同調(diào)控細胞的生長、發(fā)育、凋亡等一系列重要的生理過程。蛋白質(zhì)是行使細胞功能的主要承擔者，轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能的蛋白質(zhì)組的必然紐帶，也是生物體最重要的調(diào)控方式。特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種遺傳相關(guān)的慢性炎性皮膚疾病，病因復雜，尚未完全明確。該病有較強的遺傳背景性，現(xiàn)在認為遺傳易感性、環(huán)境因素以及免疫因素相互作用導致AD的發(fā)?。?］，從轉(zhuǎn)錄組入手，可以進一步認識疾病發(fā)病機制，是打開遺傳、環(huán)境、免疫等相互作用的鑰匙，為尋找新的干預(yù)靶點提供新思路。

一、轉(zhuǎn)錄組的歷史與進展

1995年至今的20余年，從Velculescu等［2］發(fā)現(xiàn)第一個轉(zhuǎn)錄組，到高通量測序技術(shù)誕生經(jīng)歷了10年，接著衍生的第2代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)RNA序列分析（RNA?seq）為轉(zhuǎn)錄組學研究帶來了很大的進展。近幾年，Streets等［3］利用微流控芯片技術(shù)實現(xiàn)了高質(zhì)量單細胞的全轉(zhuǎn)錄組測序。2016年，表觀轉(zhuǎn)錄組分析（epitranscriptome analysis）榮膺《自然方法》生命科學技術(shù)稱號。表觀轉(zhuǎn)錄組指的是添加到核糖核苷酸中的任何修飾，但不考慮該修飾的已知功能或遺傳性?？茖W家們越來越意識到，核糖核苷酸的化學修飾也就是表觀轉(zhuǎn)錄組在調(diào)控細胞特性中發(fā)揮的重要作用。

二、轉(zhuǎn)錄組學的應(yīng)用

轉(zhuǎn)錄組學研究已廣泛應(yīng)用于生物學、數(shù)字信息學、醫(yī)學、環(huán)境微生物學、教育學、臨床及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。在醫(yī)學領(lǐng)域，已應(yīng)用于基因診斷、基因治療和基于基因組知識的治療、基于基因組信息的疾病預(yù)防、疾病易感基因的識別、風險人群生活方式、環(huán)境因子的干預(yù)等方面，對醫(yī)學的發(fā)展起到了較大的推動作用。轉(zhuǎn)錄組學研究可進一步認識疾病發(fā)生發(fā)展過程中的機制，揭示基因突變規(guī)律，發(fā)現(xiàn)致病基因調(diào)控關(guān)鍵靶點，以及尋找新的干預(yù)靶點，建立更有效的治療策略，為探索新藥提供新的研究靶點，提供更科學的治療手段。

三、轉(zhuǎn)錄組在AD的研究進展

遺傳因素在AD的病因中占據(jù)重要地位，表觀遺傳作為介導環(huán)境與遺傳相互作用的重要機制，為研究遺傳與環(huán)境因素如何誘發(fā)AD等過敏性疾病發(fā)病提供了全新的思路和途徑，表觀遺傳調(diào)控主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA（ncRNA）等，其中ncRNA是轉(zhuǎn)錄組的重要內(nèi)容。目前AD轉(zhuǎn)錄組水平的研究也在不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組相關(guān)的靶點治療也逐步運用到臨床當中。

1.在動物模型上的轉(zhuǎn)錄組學研究：有研究［4］報道，在過度表達IL?4轉(zhuǎn)基因小鼠AD動物模型上，用PCR陣列技術(shù)檢測IL?4轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)病前后及同窩出生的野生型小鼠數(shù)以百計的炎癥相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn) CXCL5，IL?1b，IL?24，IL?6，oncostatinM，PTGS2，F(xiàn)PR1和REG3g等許多趨化因子、促炎性細胞因子與野生型小鼠相比上調(diào)幾百倍，提示IL?4轉(zhuǎn)基因小鼠中，IL?4在上皮過度表達可導致各種趨化因子、細胞因子、炎癥因子異常調(diào)節(jié)。有學者［5］用AD犬動物模型的絲聚蛋白mRNA與健康犬比較，有顯著的高表達，健康犬的絲聚蛋白免疫熒光在顆粒層和角質(zhì)層均勻分布，而AD犬顯示片狀強熒光。有研究［6］發(fā)現(xiàn)，MCP基因、IL1家族基因、跨膜受體EMR1和EMR3基因、干擾素誘導基因、生成頭發(fā)和指甲相關(guān)的角蛋白基因，在AD犬異常轉(zhuǎn)錄。Merryman?Simpson等［7］通過對AD犬的mRNA表達的基因芯片分析，在AD皮損和非皮損中有16個基因異常表達，26個基因只在非皮損表達，12個基因在皮損表達，S100A8是皮損中表達差異最明顯的，高出正常皮膚23倍。S100A8是一個表皮分化復合體的促炎性細胞因子基因。

2.在AD患者及健康人群的轉(zhuǎn)錄組學研究：白細胞介素是由多種細胞產(chǎn)生又作用于多種細胞的一類細胞因子?，F(xiàn)研究已發(fā)現(xiàn)，IL?4、IL?13、IL?22、IL?31、IL?36、IL?9等在AD皮損與正常皮膚表達或治療前后表達有差異。IL?31是AD中一個和感染及瘙癢相關(guān)的重要媒介，有研究表明，IL?31 mRNA水平和血清IL?31蛋白水平有很強的相關(guān)性，血清IL?31水平和血清IgE之間有相關(guān)性，嗜酸性粒細胞陽離子蛋白、疾病嚴重程度和瘙癢的強度在AD患者中有一定的相關(guān)性［8］。還有研究［9］發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子PU.1和IL?9在AD中的表達水平與疾病的嚴重程度和發(fā)疹類型相關(guān)。該研究通過對比30例AD患者和30例健康人血清，AD的嚴重程度采用SCORAD評分表評估，用IgE（人類）酶聯(lián)測免疫吸附試驗（ELISA）來測定血清IgE，IL?9及PU.1，通過實時定量PCR發(fā)現(xiàn)IL9及PU.1在AD中的表達明顯高于正常對照組。有研究者［10］通過RNA測序和微陣列這兩種技術(shù)識別差異表達的基因，試圖刻畫AD轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)包含217個基因，包括炎癥［S100A8/A9/A12，CXCL1 和 2′?5′?oligoadenylate合成酶像（OASL）］和屏障［MKi67，角蛋白16（k16）］，和緊密連接蛋白8［cldn8］）AD相關(guān)基因，這比用PCR的方法更準確，但也有偏差，其中運用RNA?seq唯一確定的是TREM?1通路［如CCL2，CCL3，單免疫球蛋白域IL1R1相關(guān)（SIGIRR）］和IL?36在AD患者皮損中的表達增加，為AD的機制提供了新思路。轉(zhuǎn)錄組研究比個體研究更豐富了AD的關(guān)鍵通路，把AD和一些新通路聯(lián)系起來，如動脈粥樣硬化信號（IL?37，selectin E/SELE），確定了廣泛脂質(zhì)異常和相關(guān)Th2免疫激活是下調(diào)表皮脂質(zhì)的關(guān)鍵（FA2H、FAR2、ELOVL3），強調(diào)了屏障破壞細胞因子的作用［11］。我們團隊［12］通過薈萃分析也發(fā)現(xiàn)，IL?4 590C/T多態(tài)性可能導致AD的敏感性，特別是對亞洲兒童人群。Julia等從10個AD患者的正常皮膚和急慢性皮損中通過基因、分子、細胞的轉(zhuǎn)錄組學研究發(fā)現(xiàn)，AD開始時，S100A7，S100A8和S100A9基因表達增加，且伴隨著Th2和Th22細胞因子活化。這個發(fā)現(xiàn)支持了從急性到慢性階段Th2和Th22細胞因子的活化免疫軸模型，拓展了以往對病因機制的認識觀點［13］。

MicroRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控。有研究［14］發(fā)現(xiàn)，AD患者皮膚上Th1和Th2細胞MicroRNA?155有高表達，是由過敏原和超級抗原調(diào)控，特別是在分化和激活Th細胞時。在皮膚組織上T細胞，樹突細胞，成纖維細胞和肥大細胞顯示MicroRNA?155高表達。MicroRNA?155分子參與了先天的監(jiān)管和獲得性免疫反應(yīng)，免疫細胞的發(fā)展和致癌作用［15］。Ma 等［16］研究也發(fā)現(xiàn)，MicroRNA?155可通過調(diào)節(jié)分化和輔助Th17功能來參與AD的發(fā)病機制。Rebane 等［17］發(fā)現(xiàn)，MicroRNA?146a通過抑制角質(zhì)形成細胞的先天免疫應(yīng)答來減輕AD的慢性炎癥。AD患者角質(zhì)形成細胞miR?146a，miR?10b，miR?10a，miR?10a*，miR?216，miR?921?1*，miR?454，miR?29b?1*的高表達和miR?99a*，miR?34a*，miR34c?5p，miR?30a的下調(diào)。Chen等［18］通過高通量測序，對AD患者和健康對照組血漿中的microRNA差異表達進行比較，發(fā)現(xiàn)MiR?151a通過調(diào)節(jié)IL?12 β2受體來參與AD的發(fā)病機制。此外，有研究通過多種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示除免疫介導途徑外，皮膚屏障通路，如角質(zhì)形成細胞分化通路在AD發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用。更好地了解角質(zhì)形成細胞在AD中的作用，對于發(fā)展新型的“屏障治療”是非常重要的［19］。

3.體外模型的建立：近期研究，用Th2細胞因子誘導重建表皮，構(gòu)建具有AD形態(tài)學及轉(zhuǎn)錄組學特點的體外模型。Rouaud?Tinguely等［20］選取正常人角質(zhì)形成細胞，經(jīng)炎性細胞因子（聚肌胞苷酸、TNF?α、IL?4和IL?13）誘導，角質(zhì)形成細胞分泌胸腺基質(zhì)淋巴細胞生產(chǎn)素和IL?8增加，導致特定的基因表達模式，炎癥過程促進了形態(tài)學、功能學和轉(zhuǎn)錄組學的改變，全面模擬AD炎癥背景構(gòu)建表皮，為治療AD的天然分子篩選提供了工具。

四、AD的靶點治療藥物

見表1。有了轉(zhuǎn)錄組學基因研究作厚實的奠基，相關(guān)的藥物治療也運用到臨床當中，AD的靶點治療藥物也在不斷發(fā)展。Beck等［21］在用賽諾菲（dupilumab單抗：抗IL?4和IL?13單克隆抗體）與IL?4、IL?13Ra部位結(jié)合阻斷Th2調(diào)節(jié)IL?4及IL?13的信號傳導途徑，從而抑制過敏性疾病的過程。觀察150 mg或300 mg治療前和治療4周后正常和皮損皮膚之間的轉(zhuǎn)錄組表達變化，發(fā)現(xiàn)過敏性哮喘和AD可能有相關(guān)的驅(qū)動程序，特別是IL?4和IL?13，因此治療過敏性哮喘的部分藥物同樣也可以治療AD。而目前此藥已進入AD 3期臨床試驗［22］。近期一項靶點治療首次在人體進行臨床試驗，通過抑制IL?31緩解AD瘙癢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皮下注射人源化抗人IL?31受體單克隆抗體CIM331可以明顯改善AD患者的瘙癢狀況，健康受試者和AD患者對藥物均有良好的耐受性［23］。Khattri等［24］用環(huán)孢素治療AD前后通過實時定量PCR和基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過2周和12周的治療，在正常皮膚和皮損中基因表達與臨床改善相關(guān)，特別是Th2?，Th22?和一些Th17?相關(guān)分子如，IL?13，IL?22，CCL17，S100As，elafin/p13，以及表皮增殖和分化的調(diào)節(jié)。而以IL?22為靶點的生物制劑ILV?094（fezakinumab）已經(jīng)進入了AD的2期臨床試驗。

表1 人類特應(yīng)性皮炎轉(zhuǎn)錄組研究及靶點治療藥物

五、結(jié)語

AD病因復雜，發(fā)病機制普遍認為與遺傳、環(huán)境、免疫、感染等相互調(diào)控相關(guān)，轉(zhuǎn)錄組從細胞中基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平上進一步認識其生理病理學機制。AD的病因在不斷完善，需要發(fā)現(xiàn)更多治療AD的新靶點，對該病的預(yù)防和治療都有重要意義。

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