固體和液體法在支原體檢測(cè)中的方法學(xué)評(píng)價(jià)

戶(hù)小均(通訊作者) 馬驥 李選靖

（1四川省綿陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 四川 綿陽(yáng) 621000）（2四川綿陽(yáng)四0四醫(yī)院檢驗(yàn)科 四川 綿陽(yáng) 621000）

支原體常存在于泌尿生殖道（主要是Uu和Mh），導(dǎo)致非特異性尿道炎（NGU）。致病性支原體對(duì)人體上皮細(xì)胞具有極強(qiáng)的親和性支原體定位于人體呼吸道和生殖道黏膜，從而能造成黏膜的局部細(xì)胞損傷這可能是其致病原因[1]?，F(xiàn)今檢測(cè)泌尿生殖道支原體的方法主要是培養(yǎng)法、免疫法和PCR法，但免疫法和PCR法操作復(fù)雜且價(jià)格較高，故目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)Uu和Mh的方法為培養(yǎng)法[2]。培養(yǎng)法分兩類(lèi)，分別為固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法，而在國(guó)內(nèi)較常使用液體培養(yǎng)法。液體培養(yǎng)法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不高，且操作簡(jiǎn)捷，作為WHO推薦診斷NGU的首選方法[3]；傳統(tǒng)固體培養(yǎng)法成本相對(duì)較高、耗時(shí)長(zhǎng)，雖有新型固體培養(yǎng)基應(yīng)用，縮短了培養(yǎng)時(shí)間，但也存在真菌污染情況，影響形態(tài)觀察[4]。由于固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法常出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果不一致的現(xiàn)象，本次研究對(duì)300例疑似泌尿生殖道支原體感染的標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)，比較兩種方法對(duì)Uu和Mh的檢測(cè)價(jià)值。

1.材料與方法

1.1 研究對(duì)象

300例樣本均來(lái)自2017年上半年本院疑似生殖道支原體感染者的泌尿生殖道分泌物。男性采用無(wú)菌拭子取尿道口1～1.5cm分泌物或尿沉渣（中段尿10～20ml，2000r/min離心10分鐘）；女性采用無(wú)菌拭子取宮頸口1～1.5cm處分泌物。

1.2 儀器與試劑

所選用的液體培養(yǎng)基為Uu和Mh選擇分離培養(yǎng)、鑒定、藥敏試劑盒，購(gòu)自眾愛(ài)生河北生物科技有限公司；固體培養(yǎng)基Uu和Mh的選擇分離培養(yǎng)基，購(gòu)自眾愛(ài)生河北生物科技有限公司）。儀器選擇普通光學(xué)顯微鏡和隔水恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)本在收集后盡量在2小時(shí)內(nèi)接種。固體培養(yǎng)：將標(biāo)本拭子直接滾動(dòng)連續(xù)劃線(xiàn)涂布在固體培養(yǎng)基上，并加一片二氧化碳發(fā)生片，編號(hào)后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。液體培養(yǎng)：取未接種的培養(yǎng)基液100μl加入陰性對(duì)照孔，然后將標(biāo)本拭子頭置于液體培養(yǎng)液內(nèi)充分洗滌并在瓶壁上擠干拭子，然后各取100μl滴加在除陰性對(duì)照孔的其余各孔中，滴加石蠟油覆蓋，編號(hào)后放入培養(yǎng)箱35～37℃培養(yǎng)，24～48小時(shí)后觀察結(jié)果。

1.4 結(jié)果判斷

1.4.1液體培養(yǎng)結(jié)果判定 鑒定孔無(wú)顏色變化且無(wú)混濁則為陰性；鑒定孔由黃色變成紅色且無(wú)渾濁則判定為陽(yáng)性。若陽(yáng)性孔出現(xiàn)混濁或鑒定孔陽(yáng)性而陽(yáng)性孔為陰性則視為液體培養(yǎng)污染。

1.4.2固體培養(yǎng)結(jié)果判定 培養(yǎng)24～48小時(shí)后在低倍鏡下觀察培養(yǎng)基上是否生長(zhǎng)支原體屬特征菌落，若觀察到較大且為油煎蛋狀支原體菌落則為Mh陽(yáng)性；若觀察到較小且呈圓形棕褐色支原體菌落則為Uu陽(yáng)性；若兩者都有則為Uu+Mh陽(yáng)性；若無(wú)典型支原體屬特征菌落生長(zhǎng)則為陰性；有雜菌生長(zhǎng)并影響到結(jié)果觀察的判為固體培養(yǎng)污染。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行χ2分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)陽(yáng)性檢測(cè)率

液體培養(yǎng)及固體培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表1、表2，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)兩種培養(yǎng)法對(duì)泌尿生殖道支原體檢測(cè)結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.621，P＜0.05）。

表1 固體培養(yǎng)法與液體培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果

表2 固體培養(yǎng)法與液體培養(yǎng)法陽(yáng)性率

2.2 固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)污染率

液體培養(yǎng)及固體培養(yǎng)污染率見(jiàn)表3，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，液體培養(yǎng)法污染率高于固體培養(yǎng)法（χ2=10.173，P＜0.05）。

表3 固體培養(yǎng)法與液體培養(yǎng)法污染率

3.討論

泌尿生殖道支原體檢測(cè)的常用方法為液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法，本研究采用液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法來(lái)檢測(cè)300例疑似泌尿生殖道支原體感染的標(biāo)本，結(jié)果顯示液體培養(yǎng)法陽(yáng)性率高于固體培養(yǎng)法，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其原因主要是液體培養(yǎng)法是生化反應(yīng)，特異性差，Uu或Mh在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)分解尿素或精氨酸，產(chǎn)生氨氣使培養(yǎng)基pH上升，令酚紅指示劑由黃色變?yōu)榧t色，從而確定有Uu或Mh生長(zhǎng)；然而這種反應(yīng)不是支原體特有的，當(dāng)培養(yǎng)液中存在可以分解尿素或精氨酸的其他細(xì)菌和真菌時(shí)，都會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)；而固體培養(yǎng)法特異性高，只有觀察到典型的Uu或Mh才能判定為陽(yáng)性，這就造成了液體培養(yǎng)法陽(yáng)性率高于固體培養(yǎng)法。此外，根據(jù)吳清壇研究報(bào)告可得出液體培養(yǎng)法敏感性高于固體培養(yǎng)法，這亦是固體培養(yǎng)陽(yáng)性率高于固體培養(yǎng)的原因之一；同時(shí)，由于固體培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，若未培養(yǎng)足夠的時(shí)間，則支原體可能未生長(zhǎng)或不明顯，這亦會(huì)導(dǎo)致固體培養(yǎng)的陽(yáng)性檢測(cè)率低。

液體培養(yǎng)對(duì)于確診Uu的假陽(yáng)性率為10.85%（14/129）；液體培養(yǎng)對(duì)于確診Mh的假陽(yáng)性率為42.85%（6/14）?？梢?jiàn)液體培養(yǎng)法檢測(cè)泌尿生殖道支原體更易出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。分析出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的原因主要有兩個(gè)：液體培養(yǎng)基不能完全抑制或殺滅其他具有耐藥性的微生物，而這些微生物恰好能分解尿素和精氨酸，產(chǎn)生氨氣致使培養(yǎng)基變紅而出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果；某些堿性標(biāo)本亦會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液由黃色變?yōu)榧t色，繼而出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。

此外，有5例標(biāo)本液體培養(yǎng)為陰性而固體培養(yǎng)為陽(yáng)性，這是由于采集的標(biāo)本支原體量少或標(biāo)本在培養(yǎng)液中未將支原體充分洗脫下來(lái)，導(dǎo)致培養(yǎng)時(shí)支原體含量太少，在培養(yǎng)24-48小時(shí)內(nèi)不能產(chǎn)生足夠的氨氣致使酚紅指示劑不變色或顏色變化程度不大，以致于結(jié)果判為陰性；標(biāo)本上攜帶其它細(xì)菌、細(xì)胞或真菌導(dǎo)致標(biāo)本污染，使培養(yǎng)液渾濁視為污染而判定為陰性。此外，液體培養(yǎng)中先滴加抗生素包被的微孔再滴加陽(yáng)性孔和鑒定孔，若往抗生素包被的微孔滴加培養(yǎng)液時(shí)污染了加樣槍頭且未更換槍頭，從而污染了培養(yǎng)液導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果為陰性。

結(jié)果顯示固體培養(yǎng)污染率小于液體培養(yǎng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造成污染的原因可能是：（1）標(biāo)本問(wèn)題：若采集的標(biāo)本上有雜菌、細(xì)胞或真菌，使得培養(yǎng)液混濁而將培養(yǎng)結(jié)果判為污染；（2）接種時(shí)的污染：固體培養(yǎng)接種快捷，接種完加入二氧化碳發(fā)生片后立即封閉，大大減少了其他雜菌污染培養(yǎng)基，干擾結(jié)果的可能性；而液體培養(yǎng)接種過(guò)程中，不僅需要在陽(yáng)性孔，陰性孔和鑒定孔滴加培養(yǎng)液，還需要在多個(gè)以高低濃度抗生素包被的微孔中加入培養(yǎng)液，這樣增加了接種時(shí)間，加大了雜菌污染培養(yǎng)基的機(jī)率。

綜上所述，液體培養(yǎng)法操作更方便，附帶鑒定和藥敏試驗(yàn)?zāi)芊从持гw感染程度及耐藥性，指導(dǎo)臨床合理用藥，但易漏診和誤診；固體培養(yǎng)法特異性強(qiáng)，能直觀觀察支原體典型菌落，污染率小且不易漏診和誤診，是確診支原體感染的方法，但培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。因此，兩種方法各有優(yōu)劣，臨床應(yīng)聯(lián)合兩方法檢測(cè)支原體，才能有效，快速，準(zhǔn)確地檢測(cè)出是否為支原體感染及感染程度，這對(duì)感染早期的確診以及治療具有十分重要的作用。

[1]陳忠領(lǐng)，羅凱亮.女性生殖道支原體感染及耐藥性分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（5）：599-600.

[2]黃秀榮，張群先.液體法和固體法檢測(cè)泌尿生殖道支原體的效果[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2017，17(2)：207-209.32

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[4]張艷，李蘇利.Uu檢測(cè)方法研究現(xiàn)狀[J].臨床軍醫(yī)雜志，2014，42（9）:961-963.