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    羊棲菜多糖分離工藝的研究

    2018-03-15 01:47:02高壇玉劉思淵林國榮
    農(nóng)業(yè)科技與裝備 2018年6期
    關(guān)鍵詞:固液大孔提取液

    高壇玉,劉思淵,林國榮

    (莆田學院環(huán)境與生物工程學院,福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點實驗室,福建 莆田 351100)

    羊棲菜又名海大麥、玉草等,是北太平洋西部特有的暖溫帶性海藻,廣泛分布于我國遼寧、山東、福建、浙江省沿海,具有軟堅散結(jié),利水泄熱等功效,且藻體肥厚多汁,富含多糖、膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì),以及人體所需的各種微量元素和八種必需氨基酸。它可作為工業(yè)用褐藻膠原料和藥品,臨床上多用于治療甲狀腺腫、淋巴浮腫病、腳氣病等,具有很高的食用和藥用價值。

    羊 棲 菜 多 糖 (SargassumfusiformePolyccharides,SFPS)是指從羊棲菜中提取的水溶性多糖,主要由褐藻酸和褐藻糖膠組成。羊棲菜多糖具有增強機體免疫力、抑制腫瘤細胞、抗菌和抗病毒等生理活性。多糖是羊棲菜中的主要活性成分,研究發(fā)現(xiàn)多糖的生物學功能與其化學性質(zhì)有關(guān),只有分離出多糖的有效成分并明確其結(jié)構(gòu)特征,才能進一步研究其藥理活性。

    以羊棲菜為原料,用熱水浸提法提取羊棲菜多糖粗品,篩選出最優(yōu)樹脂對羊棲菜多糖進行分離純化,確定最佳多糖提取和分離純化參數(shù),為羊棲菜多糖的開發(fā)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試供材料及處理

    將羊棲菜粉碎烘干,在冰箱中保存待用。

    1.2 主要化學試劑與儀器

    主要試劑:無水乙醇(天津市鼎盛鑫化工有限公司),苯酚(天津市鼎盛鑫化工有限公司),濃硫酸(國藥集團化學試劑有限公司),大孔樹脂HPD-100、HPD-400、HZ-801、HZ-818、NKA-9、LSA-5 (上海藍季科技發(fā)展公司)。

    主要儀器:SartoriusBS224S電子天平(Sartorius公司)、DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精勝科學儀器有限公司)、YZ1515x衡流泵(保定蘭格衡流泵有限公司)、722型可見光分光光度計(上海精密科學儀器公司)、pH計 (廈門精益興業(yè)公司)、BS-100A收集器(蘇州江東精密儀器有限公司)、SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 多糖標準曲線的制作

    1)葡萄糖標準溶液配制 用分析天平精密稱取干燥后的葡萄糖5.00mg,加適量水溶解并于50 mL容量瓶中定容,配置成0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

    2)葡萄糖標準曲線制作 用移液管從上述配制的葡萄糖標準溶液中分別吸取 0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL,轉(zhuǎn)入干凈試管中,補加去離子水至1 mL。然后,運用硫酸-苯酚法依次加入2.5mL濃硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液,搖勻并冷卻到室溫后靜置20 min。以第一管為空白,在490 nm處測定吸光度A,再以吸光度A為縱坐標、糖濃度C為橫坐標,得到回歸方程。

    1.3.2 提取工藝的確定取羊棲菜粉末 5.0 g,分別加入75 mL的去離子水和75 mL的乙醇,在60℃的水浴鍋中提取2 h,再取5.0 g羊棲菜粉末加入75 mL去離子水在60℃超聲波環(huán)境下提取0.5 h,通過測其吸光度選出最佳提取工藝。其次,取羊棲菜粉末5.0 g,運用最好的提取方法分別在45℃、60℃、75℃、90℃下加熱2 h,得到不同溫度下的羊棲菜多糖提取液,確定最優(yōu)提取溫度。再次,按照 1∶10,1∶12.5,1∶15,1∶20固液比,在上述試驗后的最優(yōu)溫度下水浴加熱2 h,確定最優(yōu)提取固液比。最后,在水浴加熱時間為1.5 h,2 h,2.5 h,3 h 的條件下,按照上述試驗所得的最適溫度和最適提取固液比進行試驗,確定最適提取時間,即可確定羊棲菜多糖適宜提取工藝。

    將上述不同條件下所得的提取液取1 mL于干燥潔凈的試管中,依次加入2.5 mL濃硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液,邊滴加邊震蕩,冷卻至室溫后靜置20 min,在490 nm處測其吸光度。

    1.3.3 樹脂的篩選

    1)樹脂預(yù)處理 樹脂經(jīng)預(yù)處理并用水沖洗,直到無色無味。

    2)靜態(tài)吸附 選用大孔樹脂 HPD-100、HPD-400、HZ-801、HZ-818、NKA-9、LSA-5 各 5 mL, 分別加入羊棲菜多糖提取液80 mL,在100 r/min搖床上5次吸附。第一次為吸附2 h測一次吸光度,此后每隔1 h測一次吸光度,共吸附6 h。然后,將所得吸附液取1 mL于干燥潔凈的試管中,依次加入2.5 mL濃硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液,邊滴加邊震蕩,冷卻至室溫后靜置20 min,在490 nm處測其吸光度。

    3)靜態(tài)洗脫 在吸附后的樹脂中加入60 mL 50%的乙醇,洗脫3h后將所得洗脫液取1 mL于干燥潔凈的試管中,依次加入2.5 mL濃硫酸和0.5m L6%苯酚溶液,邊滴加邊震蕩,冷卻至室溫后靜置20 min,在490 nm處測其吸光度。

    1.3.4 動態(tài)吸附

    1)飽和吸附。NKA-9樹脂在無水乙醇中浸泡24 h,用去離子水洗至中性。在層析柱中加入15 mL濕樹脂,以2 BV的流速吸附羊棲菜多糖的提取液。經(jīng)分部收集器收集得到漏出液,并在490 nm處測定吸光度。

    2)動態(tài)吸附。采用水提取方式,1∶15固液比,在90℃條件下提取3 h得到提取液。經(jīng)無水乙醇浸泡NKA-9樹脂24 h后,用去離子水洗至中性,在玻璃層析柱中裝填15 mL濕樹脂,加入100 mL羊棲菜多糖提取液,在1 BV、2 BV、3 BV三種不同流速下進行動態(tài)吸附,以篩選出最優(yōu)提取效果下的流速,再進行不同上樣濃度的吸附。 按照 1∶10,1∶15,1∶20 不同固液比,在90℃下取提取液100 mL,在玻璃層析裝填15 mL濕樹脂,在最適流速下進行吸附處理。

    取上述不同條件下的吸附液1 mL于干燥潔凈的試管中,依次加入2.5 mL濃硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液,邊滴加邊震蕩,冷卻至室溫后靜置20 min,在490 nm處測其吸光度。

    1.3.5 動態(tài)洗脫對上述完成動態(tài)吸附的樹脂柱用去離子水淋洗,然后低溫保存處理。

    取動態(tài)吸附后的樹脂15 mL填裝于玻璃層析柱中,然后用50%、60%和70%乙醇溶液120 ml進行洗脫處理,流速為2BV。 然后,以120 ml最佳乙醇濃度進行洗脫處理,流速為1BV、2BV和3 BV。取上述不同條件下的吸附液1 mL于干燥潔凈的試管中,依次加入2.5 mL濃硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液,邊滴加邊震蕩,冷卻至室溫后靜置20 min,在490 nm處測其吸光度。

    1.3.6 純度測定

    精準稱取制備好的的樣品,用甲醇作為溶劑,將樣品溶解并定容至10 mL,同上法測定溶液吸光度,通過標準曲線計算出純化后的多糖濃度,按照下式計算純度:

    式中,C為通過標準曲線計算出的純化后果皮花青素的濃度,mg/mL, V 為定容體積,10 mL,m 為精準稱取的樣品質(zhì)量,mg

    2 結(jié)果與分析

    2.1 多糖標準曲線的制作

    羊棲菜多糖標準曲線見圖1。

    圖1 多糖標準曲線Figure 1 Standard curve of polysaccharide

    樣液吸光度為A490 nm=7.430,代入圖1標準曲線方程,得出樣液羊棲菜多糖質(zhì)量濃度為1.046 mg/mL。

    表1 不同提取方式對羊棲菜多糖提取的影響Table 1 Effect of different extraction mode on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

    2.2 提取工藝的確定 不同提取方式對羊棲菜多糖提取的影響見表1。

    2.2.1 提取方式的確定由表1可以看出,水提取法效果最好,乙醇提取法次之,超聲波提取效果最差,故本試驗選用水提取方式提取羊棲菜中的多糖。

    2.2.2 提取溫度的確定不同溫度對羊棲菜多糖提取的影響見圖2。

    由圖2可以看出,水提取法中羊棲菜多糖的提取效果隨著溫度的增加而增大,且增加幅度隨溫度升高而呈遞增趨勢。60℃之前,多糖提取量隨溫度升高而增加的速度較緩慢,在溫度達到60℃以后,隨著水浴溫度的提高,多糖分子熱運動隨之加快,多糖提取量亦隨之增加,60~75℃之間增速較快,75~90℃之間達到最快增速,溫度達到90℃時為最佳提取效果。

    圖2 不同溫度對羊棲菜多糖提取的影響Figure 2 Effect of different temperature on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

    2.2.3 最適提取固液比的確定不同固液比對羊棲菜多糖提取的影響見圖3。

    圖3 不同固液比對羊棲菜多糖提取的影響Figure 3 Effect of different solid-to-liquid ratio on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

    由圖3可以看出,多糖提取效果隨固液比的變化而變化。當固液比小于1:15時,多糖提取效果逐漸遞增;當固液比為1∶15時,羊棲菜多糖提取效果最好;隨著固液比增大,其提取效果逐漸降低。造成此現(xiàn)象的原因是:當固液比小于1∶15時,其羊棲菜多糖沒有完全溶解于水中,故提取效果較差;當固液比大于1∶15時,其溶液中水較多,對羊棲菜多糖起到稀釋作用,且固液比越大,其溶液中多糖濃度就越小,繼而提取效果隨之下降。

    2.2.4 不同時間條件下提取效果不同時間對羊棲菜多糖提取的影響見圖4。

    圖4 不同時間對羊棲菜多糖提取的影響Figure 4 Different time on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

    由圖4可以看出,羊棲菜多糖提取量隨提取時間的增加而呈遞增趨勢,且隨著時間的增加,多糖提取量的增大趨勢逐漸減緩。當提取時間達到3 h時,多糖提取效果最好。

    2.3 大孔樹脂分離工藝的確定

    2.3.1 大孔樹脂篩選 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果見表2。

    表2 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果Table 2 Static adsorption and desorption results of macroporous resin

    從表2可知,隨著時間的增加各個大孔樹脂的吸附量逐漸增大,對羊棲菜多糖提取而言,吸附量最佳的是NKA-9,HZ-818次之,HPD-400最差;洗脫效果最好的是NKA-9,HZ-818次之,其中HB-801最差。由于NKA-9吸附能力最佳,洗脫效果最好且解吸率最高,故后續(xù)試驗采用NKA-9型大孔樹脂。

    2.3.2 NKA-9大孔樹脂對多糖飽和吸附量確定NKA-9大孔樹脂飽和吸附曲線見圖5。

    由圖5可以看出,以2BV的速度進行吸附,當上樣量達到85 mL時,其吸附液吸光度變化很小,趨近于原液的40.71,但仍呈上升趨勢。其最大吸附量為106.95 mg/mL,故決定動態(tài)吸附時的上樣量為100 mL。

    圖5 NKA-9大孔樹脂飽和吸附曲線Figure 5 Saturation adsorption curve of NKA-9 macroporous resin

    2.4 動態(tài)吸附

    2.4.1 NKA-9大孔樹脂在不同流速下吸附效果不同流速下NKA-9大孔樹脂的吸附曲線見圖6。

    圖6 不同流速下NKA-9大孔樹脂的吸附曲線Figure 6 Adsorption curve of NKA-9 macroporous resin with different flow rate

    從圖6中可以看出,當流速為2 BV時,NKA-9對多糖的吸附效果明顯優(yōu)于1 BV和3 BV。吸附流速不同時會影響多糖在樹脂中的擴散速度,吸附效果受溶質(zhì)在樹脂表面擴散速度的的影響。當流速為3 BV時,流速過大會導(dǎo)致樹脂吸附量降低。當流速為1 BV時,吸附流速過小會導(dǎo)致吸附時間增加。當流速為2 BV時,其吸附效果最好,達到飽和時的上樣體積為100 mL。

    2.4.2 NKA-9大孔樹脂在不同濃度下吸附效果不同濃度下NKA-9大孔樹脂的吸附曲線見圖7。

    圖7 不同濃度下NKA-9大孔樹脂的吸附曲線Figure 7 Adsorption curve of NKA-9 macroporous resin with different concentration

    從圖7可以看出,不同濃度的提取液其吸附效果具有較為明顯的差異。濃度越大時,提取液中的溶質(zhì)極易造成大孔樹脂堵塞,導(dǎo)致吸附效果上升緩慢;提取液濃度越小,其吸附時達到飽和所需要的提取液就越多。因此,羊棲菜多糖吸附的最適濃度為1.671 mg/mL。

    2.5 動態(tài)洗脫

    2.5.1 不同乙醇濃度下洗脫效果不同濃度下NKA-9大孔樹脂的洗脫曲線見圖8。

    從表8可以看出,乙醇濃度越大其洗脫效果越好,當乙醇濃度達到70%時洗脫率最高,但到洗脫后期出現(xiàn)較明顯的尾部。當乙醇濃度達到50%時,其洗脫效果遠不及60%和70%乙醇的洗脫效果,故以60%乙醇為最佳洗脫濃度。

    2.5.2 不同流速下洗脫效果不同流速下 NKA-9大孔樹脂的洗脫曲線見圖9。

    圖9 不同流速下NKA-9大孔樹脂的洗脫曲線Figure 9 Elution curve of NKA-9 macroporous resin with different flow rate

    從圖9可以看出,NKA-9大孔樹脂的洗脫效果與流速呈正相關(guān)。當流速達到3 BV時,洗脫出現(xiàn)高點,但在2 BV時其洗脫曲線呈現(xiàn)出更好的對稱性,據(jù)此確定出2 BV的乙醇為最佳洗脫時的流速。

    2.5.3 純度測定精密稱取冷凍干燥后的樣品 0.0056 g,測定溶液吸光度,計算得到分離后的果皮多糖濃度為 0.353 mg/mL,純度達到了 63.1%。

    3 結(jié)論

    羊棲菜多糖是從全藻中提取的一種水溶性多糖,包括褐藻酸、褐藻多糖硫酸酯及褐藻淀粉,具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血糖和促進機體生長發(fā)育等多種藥理活性。試驗表明:羊棲菜在1∶15的固液比,90℃溫度加熱3 h后,其提取效果最好。選用NKA-9大孔樹脂進行吸附時,最適上樣濃度為1.671 mg/mL,最適流速為2 BV;洗脫時流速為2 BV,乙醇濃度為60%,獲得羊棲菜多糖的純度達到63.1%。

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