花椒化學(xué)誘變育種技術(shù)研究

唐 偉，李佩洪，龔 霞，陳 政,楊代宇(四川省植物工程研究院，四川 資中 641200)

花椒是蕓香科以種子繁殖的落葉灌木或小喬木，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)樹種之一。由于經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高，我國(guó)對(duì)花椒的研究頗多，花椒優(yōu)良品種的培育，花椒病害的預(yù)防，花椒的采收及加工是目前花椒研究的主要方向。目前雖然有一些花椒人工育成品種，但遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)的需求。因此開辟花椒育種新途徑具有重大研究意義。

化學(xué)誘變育種是利用化學(xué)誘變劑人工誘發(fā)植物發(fā)生變異，在分離后代中對(duì)突變體進(jìn)行篩選和鑒定，培育出生產(chǎn)上能直接或間接利用的農(nóng)作物品種的方法。這種方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于大豆、玉米、水稻、油菜、花卉、蔬菜、杉木、茶樹等植物育種，還應(yīng)用于部分微生物育種上。但是，目前僅有一篇碩士論文關(guān)于花椒化學(xué)誘變育種方面的相關(guān)研究。薛惠丹等人以鳳縣大花炮花椒的愈傷組織為材料，以EMS為誘變劑進(jìn)行人工誘變?cè)囼?yàn)?；ń窞閱涡越Y(jié)實(shí)，屬于無融合生殖，不易進(jìn)行雜交育種，在此之前對(duì)花椒的相關(guān)育種研究都是采取自然狀態(tài)下的優(yōu)選育種，進(jìn)行新材料選育的時(shí)間太長(zhǎng)，且沒有目的性，育種效果不佳。因此，利用化學(xué)誘變的方法對(duì)花椒進(jìn)行育種研究，克服選擇育種方法的局限性，增加遺傳物質(zhì)變異重組幾率、縮短育種周期、提高育種效率變得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 誘變材料的選擇

植物的各個(gè)部分都可作為誘變材料，但為了獲得較高的突變頻率和保證植物能進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，最終產(chǎn)生新的個(gè)體，選擇合適的誘變材料是誘變育種的關(guān)鍵之一，所以根據(jù)處理材料的性質(zhì)和誘變方法我們選擇花椒種子作為誘變材料。它的優(yōu)點(diǎn)是操作方便，可以大量處理，處理后可在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)保持生物學(xué)效應(yīng)。另外，種子對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，可以在高溫、低溫、高真空等惡劣條件下進(jìn)行誘變處理。

1.1.1 誘變材料 花椒材料選擇目前主栽品種青花椒(九葉青)種子作為處理對(duì)象。

1.1.2 誘變種子數(shù)量 4種藥劑處理，3個(gè)催芽時(shí)間處理，3個(gè)誘變時(shí)間處理，3個(gè)對(duì)照組。每個(gè)處理1000粒，一共需要的種子量為：1000×[(3×3×4)+3]=39000粒。

1.1.3 誘變劑的選擇

1.1.3.1 EMS(甲基磺酸乙酯) EMS誘變誘發(fā)突變頻率高，有益變異多，對(duì)處理材料損傷較小，而產(chǎn)生的突變多為點(diǎn)突變，染色體畸變相對(duì)較少，可以針對(duì)植物某一性狀進(jìn)行有效改良。

1.1.3.2 NaN3(疊氮化鈉) NaN3是一種點(diǎn)突變劑，具有高效、無毒、價(jià)格便宜、使用安全等優(yōu)點(diǎn)。

1.1.3.3 PYM(平陽(yáng)霉素) PYM是一種新的誘變劑，在許多實(shí)驗(yàn)中均被證明為具有安全，高效，誘變頻率高、范圍大等特點(diǎn)。

1.1.3.4 秋水仙素 秋水仙素的分子結(jié)構(gòu)與基因分子的堿基相似，它在不妨礙基因復(fù)制的情況下組成基因的成分參入到基因分子中去。但由于秋水仙素中的取代基與正常堿基不同，所以它在參入基因分子時(shí)或以后，會(huì)使基因復(fù)制時(shí)發(fā)生偶然配對(duì)上的差錯(cuò)，從而導(dǎo)致基因突變。

1.2 誘變處理方法

1.2.1 誘變種子的處理 由于花椒種子外殼有一層蠟質(zhì)層，需要先用紗布包裹搓洗，將蠟質(zhì)層去掉。然后在培養(yǎng)箱里浸潤(rùn)催芽，溫度28℃，濕度60%，催芽時(shí)間7～21d，觀察到種子開始破殼萌動(dòng)立即進(jìn)行分批誘變處理。

1.2.2 誘變劑的配制

1.2.2.1 EMS 在通風(fēng)廚中用0.06mol/L，pH=7.0的磷酸緩沖液配制濃度為0.8%的EMS溶液。

1.2.2.2 NaN3在通風(fēng)廚中用0.06mol/L，pH=7.0的磷酸緩沖液配制濃度為0.8%的NaN3溶液。

1.2.2.3 PYM 在通風(fēng)廚中用0.06mol/L，pH=7.0的磷酸緩沖液配制濃度為0.4%的PYM溶液。

1.2.2.4 秋水仙素 在通風(fēng)櫥中用0.9%的NaCl溶液配制0.5%的秋水仙素溶液。

1.2.2.5 對(duì)照 蒸餾水。

1.2.3 花椒種子的處理 將3批次催芽后的種子分別在4種誘變劑溶液中浸泡8h，16h，24h，再用清水沖洗8h。

1.2.4 播種 采用育苗盤進(jìn)行播種，基質(zhì)選擇草炭+蛭石+珍珠巖(8∶4∶1)，澆透水后放置1d，基質(zhì)濕度以手握成團(tuán)，擠不出水為宜。按36個(gè)處理加3個(gè)對(duì)照組進(jìn)行分區(qū)播種，播種后覆膜，保溫保濕，利于種子發(fā)芽。待幼苗長(zhǎng)出3片真葉即可假植至試驗(yàn)苗圃，株距為20cm。

1.2.5 誘變結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析 觀測(cè)指標(biāo)為致死率，出苗時(shí)間，苗期生長(zhǎng)勢(shì)，變異苗數(shù)量及性狀特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 催芽時(shí)間對(duì)花椒種子誘變結(jié)果的影響

通過種子發(fā)芽情況的統(tǒng)計(jì)，種子的致死率隨著催芽時(shí)間的增加而提高，種子的萌發(fā)過程受化學(xué)誘變劑的影響，從而產(chǎn)生生理變化，在催芽時(shí)間為3周時(shí)致死率為60%左右，在安全范圍內(nèi)。因此，選擇3周作為花椒種子化學(xué)誘變育種的催芽時(shí)間最為恰當(dāng)。

表1 4種化學(xué)誘變劑對(duì)萌發(fā)種子的致死率影響

2.2 誘變處理時(shí)間對(duì)花椒種子誘變結(jié)果的影響

通過統(tǒng)計(jì)種子的出苗率對(duì)比不同誘變劑處理時(shí)間對(duì)種子的發(fā)芽率影響，4種誘變劑在16h的時(shí)候致死率均保持在50%左右，符合誘變處理的致死范圍。

表2 誘變劑處理時(shí)間對(duì)萌發(fā)種子的致死率影響

通過與未經(jīng)處理的種子出苗時(shí)間對(duì)比，證實(shí)了化學(xué)誘變劑能明顯抑制花椒種子的發(fā)芽，處理時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越顯著。且PYM和秋水仙素的抑制作用大于EMS和NaN3，因此誘變劑在種子萌發(fā)過程中所發(fā)生的生理作用就越大，在能保證出苗率的情況下，可選擇PYM和秋水仙素作為合適的化學(xué)誘變劑。

表3 誘變劑處理時(shí)間種子出苗時(shí)間的影響

2.3 誘變劑種類對(duì)花椒種子誘變結(jié)果的影響

試驗(yàn)測(cè)量花椒幼苗生長(zhǎng)高度表明，EMS處理對(duì)幼苗生長(zhǎng)有一定促進(jìn)作用，平均苗高優(yōu)于其他3組和對(duì)照組；NaN3處理對(duì)幼苗生長(zhǎng)存在抑制作用，高度均低于其他處理和對(duì)照組；PYM和秋水仙素處理苗高接近對(duì)照組。

表4 誘變劑種類對(duì)花椒幼苗高度的影響

試驗(yàn)測(cè)量花椒幼苗莖粗情況表明，EMS、NaN3和PYM處理和對(duì)照組接近；秋水仙素處理對(duì)莖粗有一定影響，莖粗大于其他3組和對(duì)照組。

表5 誘變劑種類對(duì)花椒幼苗莖粗的影響

2.4 誘變劑處理產(chǎn)生的變異情況統(tǒng)計(jì)

2.4.1 花椒出苗子葉數(shù)量改變 花椒種子正常出苗子葉數(shù)量為2片，經(jīng)過誘變劑處理的種子在出苗期發(fā)生了子葉數(shù)量變異，出現(xiàn)了3、4、7片子葉的情況(見圖1)。

圖1 花椒苗子葉變異情況

變異數(shù)量與處理時(shí)間長(zhǎng)短、催芽時(shí)間長(zhǎng)短、誘變劑種類均有關(guān)。處理時(shí)間越長(zhǎng)，出現(xiàn)子葉變異數(shù)量越多，催芽時(shí)間越長(zhǎng)，出現(xiàn)的變異數(shù)量越多，PYM和秋水仙素處理的種子變異數(shù)量較多。秋水仙素組出現(xiàn)了7片子葉的罕見情況。

圖2 變異株性狀

2.4.2 花椒苗期性狀的改變 PYM處理組出現(xiàn)了花椒植株全株性狀改變，葉片較九葉青花椒更短小，葉片油腺點(diǎn)減少，葉色加深，葉片氣味改變，復(fù)葉數(shù)量由9片變?yōu)?片，枝條硬度加強(qiáng)，對(duì)紅蜘蛛的抗性增加(圖2)。

3 結(jié)論

(1)催芽時(shí)間越長(zhǎng)，花椒種子致死率越高，種子出苗時(shí)間越遲，種子出苗后產(chǎn)生的畸變?cè)蕉?。因此在可控的致死率范圍?nèi)，選擇催芽3周的花椒種子作為誘變處理材料最為適宜。

(2)花椒種子的致死率隨誘變劑處理時(shí)間增加而提高，在處理時(shí)間為16h時(shí)，致死率控制在60%左右，在有效的安全范圍內(nèi)。

(3)4種誘變劑在誘變處理花椒種子上，PYM和秋水仙素出現(xiàn)的變異數(shù)量較其他EMS和NaN3多，因此可選擇PYM和秋水仙素作為今后的常用誘變?cè)噭?/p>

(4)篩選出針對(duì)花椒種子誘變育種的兩種最佳誘變方法組合為：①PYM+催芽3周+誘變16h。②秋水仙素+催芽3周+誘變16h。

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