Cobase602全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)胃泌素釋放肽前體的性能分析

林麗珍，王建偉，鄭欽欽

(1、廈門(mén)大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350007；2、福建省立醫(yī)院南院福建省立金山醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州350008)

小細(xì)胞肺癌(SCLC)生長(zhǎng)迅速，易復(fù)發(fā)及早期轉(zhuǎn)移，而對(duì)放療和化療敏感，因此，對(duì)其早期診斷和合理治療尤為重要[1-4]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)是公認(rèn)的SCLC腫瘤標(biāo)志物，已應(yīng)用于臨床多年。血清胃泌素釋放肽前體(ProGRP)是目前應(yīng)用較活躍的新的SCLC腫瘤標(biāo)志物，正逐步用于臨床[4，5]。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)是 ProGRP 相對(duì)經(jīng)典的檢測(cè)方法，隨著技術(shù)的不斷革新，電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)ProGRP正被廣泛應(yīng)用。采用電化學(xué)發(fā)光法，可以及時(shí)檢測(cè)，自動(dòng)化程度更高，減少人工誤差，同時(shí)可大大縮短檢測(cè)時(shí)間[6]。根據(jù)ISO15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)[7，8]，必須對(duì)其檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，本文通過(guò)分析其精密度、線性、回收率、參考范圍等，從而評(píng)價(jià)該法對(duì)ProGRP檢測(cè)的性能。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本來(lái)源 來(lái)自2016年5月13日至5月17日福建省立金山醫(yī)院免疫實(shí)驗(yàn)室接收的23份我院國(guó)內(nèi)體檢健康人血清標(biāo)本。

1．2 儀器與試劑

1．2．1 試劑 胃泌素釋放肽前體檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：190275）、胃泌素釋放肽前體定標(biāo)液（18819）、胃泌素釋放肽前體質(zhì)控液（低水平批號(hào)：186304，高水平批號(hào)：186305），試劑均來(lái)自上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司。

1．2．2 儀器 Roche Cobase602全自動(dòng)免疫分析儀（上海羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）。

1．3 檢測(cè)方法

1．3．1 精密度評(píng)價(jià) 按照CLSI EP15-A2標(biāo)準(zhǔn)：2個(gè)濃度水平，5d實(shí)驗(yàn)，每天一批，每批每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定3次。

1．3．2 線性評(píng)價(jià) 選擇低濃度(L)和高濃度(H)患者標(biāo)本各1份，濃度覆蓋儀器說(shuō)明書(shū)給出的線性范圍，H和L按等比關(guān)系配制形成系列濃度血清（ 如 ：1L，0．8L+0．2H，0．6L+0．4H，0．4L+0．6H，0．2L+0．8H，1H）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品在檢測(cè)系統(tǒng)上重復(fù)測(cè)定2次，記錄結(jié)果。將實(shí)測(cè)值與預(yù)期值作比較。采取平均斜率來(lái)確定系列樣品應(yīng)含有的待測(cè)物的預(yù)期值(X)，所有樣品重復(fù)測(cè)定的均值為實(shí)測(cè)值(Y)，將所有結(jié)果點(diǎn)在X-Y坐標(biāo)圖上，計(jì)算回歸方程：Y=bX+a。1．3．3 回收率 選擇一患者標(biāo)本 （濃度為 28．6pg/ml）為基礎(chǔ)樣本，取 900μl基礎(chǔ)樣本和 100μl蒸餾水作為對(duì)照樣本，分別取900μl基礎(chǔ)樣本、10μl濃度為224Pg/ml和90μl蒸餾水作為回收樣品1；取900μl基礎(chǔ)樣本、60μl濃度為 224Pg/ml和 40μl蒸餾水作為回收樣品2；取900μl基礎(chǔ)樣本、90μl濃度為224Pg/ml和10μl蒸餾水作為回收樣品3。每份樣品在檢測(cè)系統(tǒng)上測(cè)定2次，取平均值。根據(jù)以下公式計(jì)算回收率：回收率=回收濃度/加入濃度×100%；回收濃度=最終測(cè)定濃度-基礎(chǔ)樣本濃度；加入濃度=標(biāo)準(zhǔn)品濃度×標(biāo)準(zhǔn)品體積/（標(biāo)準(zhǔn)品體積+基礎(chǔ)樣本體積）[9]。

1．3．4 參考區(qū)間 參考 NCCLSC28-A2， 通過(guò)測(cè)定23份我院國(guó)內(nèi)體檢健康人血清標(biāo)本，對(duì)＜69．2Pg/ml的生物參考區(qū)間進(jìn)行驗(yàn)證；若20份標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果均在參考區(qū)間內(nèi)或僅有2個(gè)標(biāo)本超出，則驗(yàn)證通過(guò)。否則，進(jìn)行參考區(qū)間確立實(shí)驗(yàn)。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均在SPSS 20．0統(tǒng)計(jì)軟件包以及EXCEL表格上進(jìn)行。線性評(píng)價(jià)中，計(jì)算出回歸方程：Y=bX+a。若相關(guān)系數(shù)r≥0．975，b 在 0．95～1．05 范圍內(nèi)，a 接近于 0 （小于高值標(biāo)本濃度的1%），則可判斷線性范圍；若a不接近于 0，則做 a 與 0 差異的 t檢驗(yàn)，若 t＜t(0．05，v)，v=n-2，說(shuō)明截距是由統(tǒng)計(jì)引入的，實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)曲線能通過(guò)原點(diǎn)，該測(cè)定方法在實(shí)驗(yàn)涉及的濃度范圍內(nèi)呈線性。

2 結(jié)果

2．1 精密度驗(yàn)證 低、高水平樣本檢測(cè)的批內(nèi)精密度均＜1/4TEa，批間精密度均＜1/3TEa。該檢測(cè)方法的批內(nèi)及批間精密度均符合廠家要求小于10%（見(jiàn)表 1）。

表1 精密度驗(yàn)證結(jié)果

2．2 線性范圍驗(yàn)證 ProGRP 在 10．59～1565．5pg/ml范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系 （廠家線性范圍3～5000Pg/ml），R2=0．9975，b=0．985 在 0．95～1．05 范圍內(nèi)；a=5．086，經(jīng)t檢驗(yàn)顯示 a與 0無(wú)顯著性差異（P＞0．05)(見(jiàn)表 2，如圖 1)。

2．3 回收實(shí)驗(yàn) 根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算的檢測(cè)平均回收率為 100．8%（見(jiàn)表 3）。

2．4 參考區(qū)間 參考區(qū)間為＜69．2Pg/ml。其中23份標(biāo)本全部在該參考范圍內(nèi)，所檢測(cè)的結(jié)果100%在參考范圍之內(nèi)，大于允許值90%，因此我室目前的參考范圍經(jīng)驗(yàn)證可用。（見(jiàn)表4）

表2 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果

表3 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖

3 討論

肺癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有惡性度高、發(fā)病快等特點(diǎn)。小細(xì)胞肺癌占肺癌的20%～25%，是一種未分化、惡性程度高、病因復(fù)雜的惡性腫瘤，其生長(zhǎng)迅速，易早期轉(zhuǎn)移，且對(duì)放療和化療高度敏感，SCLC的早期診斷是提高療效的關(guān)鍵。然而早期SCLC缺乏特異性癥狀和體征，影像學(xué)檢查在SCLC早期診斷中具有很大的局限性。SCLC相關(guān)血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)具有較高的靈敏度，血液標(biāo)本易獲取和無(wú)創(chuàng)等特點(diǎn)，在SCLC的診斷及治療過(guò)程中日益受到重視[10，11]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)作為SCLC標(biāo)記物，其應(yīng)用于臨床診斷已多年，但在局限性SCLC診斷中，常出現(xiàn)陽(yáng)性率過(guò)低，標(biāo)本易受溶血、脂血影響[12，13]。胃泌素釋放肽前體（ProGRP）是目前應(yīng)用較活躍的一種新的小細(xì)胞肺癌腫瘤標(biāo)志物，其敏感性、特異性和可靠性均優(yōu)于NSE，作為診斷小細(xì)胞肺癌最明確的指標(biāo)正逐步用于臨床。

表4 參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果

ProGRP是胃泌素釋放肽（GRP）的前體結(jié)構(gòu)。而GRP和ProGRP在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及其治療中起著重要的作用。ProGRP顯示GRP水平和GRP基因表達(dá)，是SCLC的一種新的腫瘤標(biāo)志物，在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。由于SCLC具有神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的性質(zhì)，因此ProGRP和NSE在SCLC的診斷中具有良好的診斷價(jià)值[14，15]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)檢測(cè)ProGRP相對(duì)經(jīng)典的檢測(cè)方法，然而由于手工方法加樣、洗滌，溫育、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線等操作步驟多，則重復(fù)性較差，人為誤差較大，這就迫切需要革新技術(shù)，全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光應(yīng)運(yùn)而生。在Cobase602全自動(dòng)化免疫分析儀上用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)檢測(cè)胃泌素釋放肽前體（ProGRP)重復(fù)性好，人為誤差小。

對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)或檢測(cè)方法進(jìn)行性能評(píng)價(jià)是臨床檢驗(yàn)質(zhì)量管理的重要內(nèi)容。精密度是反映檢測(cè)系統(tǒng)整體性能的首要指標(biāo)，也是進(jìn)行其他方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的前體[16]。本研究精密度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)按照EP15-A2文件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示在Cobase602全自動(dòng)化免疫分析儀上用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)檢測(cè)胃泌素釋放肽前體（ProGRP)，其低、高水平批內(nèi)精密度均＜1/4TEa，批間精密度均＜1/3TEa，均小于廠家聲明的最小CV。線性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)根據(jù)CLSI EP6-A文件，采用簡(jiǎn)便的平均斜率法，結(jié)果顯示在Cobase602全自動(dòng)化免疫分析儀上用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)檢測(cè)胃泌素釋放肽前體 （ProGRP)，在3-5000Pg/ml范圍內(nèi)具良好線性關(guān)系 （Y=0．9854X+5．0860，R2=0．9975），達(dá)到廠家的檢測(cè)聲明。 在定量分析驗(yàn)證時(shí)，準(zhǔn)確度通常可用回收率表示，回收率越接近100%表明分析方法準(zhǔn)確度越高。本研究回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基于磁珠法的HBVDNA檢測(cè)回收率為100．8%，接近100%，準(zhǔn)確度高[17]。根據(jù)NCCLSC28-A2， 參考區(qū)間為＜69．2pg/ml驗(yàn)證試驗(yàn)通過(guò)?？傊?，在Cobase602全自動(dòng)化免疫分析儀上用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)檢測(cè)胃泌素釋放肽前體（Pro-GRP)，實(shí)現(xiàn)了快速縮短檢測(cè)時(shí)間、重復(fù)性好、人為誤差小，具有良好檢測(cè)性能，適合臨床實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

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