布魯桿菌病常規(guī)血清學與細菌學檢測方法的臨床應用比較

王馥香

(南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院檢驗科，河南 南陽473000)

布魯桿菌?。˙rucellosis，簡稱布?。┦怯刹剪敆U菌侵入機體引起的慢性變態(tài)反應性傳染病，可感染人類、多種野生動物和多種家畜。布魯桿菌病在世界上170多個國家和地區(qū)之間流行，共約500～600萬布魯桿菌病患者，每年約50萬新發(fā)患者，嚴重威脅著人類和動物的生命健康，大大影響了畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全，帶來了巨大的經(jīng)濟損失[1-3]，年經(jīng)濟損失高達數(shù)十億美元。目前只有澳大利亞和英國通過嚴格的防疫措施徹底消滅了布魯桿菌病。布魯桿菌病仍是全球特別是發(fā)展中國家面臨的主要公共衛(wèi)生問題之一，我國將人間布魯桿菌病法定為乙類傳染病。患病的豬、牛、羊為主要的傳染源，牧民和獸醫(yī)是主要的感染者，病原菌通過呼吸道、消化道、損傷的皮膚或黏膜等途徑傳播。布病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸復雜，與多種疾病類似，臨床上難以鑒別診斷，易被誤診[4-6]。布病的預防和控制的關鍵是對致病微生物的快速、準確地檢測和診斷。目前用于布病的主要診斷技術有：細菌學檢測、血清學檢測（虎紅平板凝集試驗(RBPT)、平板凝集試驗（RPST）、試管凝集試驗（SAT）、補體結合試驗（CFT）、膠體金免疫層析法(GICA)、抗球蛋白試驗(Coomb's試驗或 AGT)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA)、核酸檢測（PCR）等[7-9]。目前，布魯桿菌病的診斷方法種類越來越多，但是至今還沒有一種具有特異性、敏感性、易行、操作簡單、快速等優(yōu)點的檢測方法。為了能夠更好地對布病患者進行診斷，為臨床治療提供科學依據(jù)，本文對在本院2014年1月至2016年4月期間門診和住院治療的布病患者接受 RBPT、SAT、iELISA以及細菌學檢測的結果進行回顧性分析，報告如下。

1 材料與方法

1．1 一般資料 142例2014年1月至2016年4月在我院門診和住院的布病患者，以及50例健康體檢者作為對照。其中男108例，年齡28～62歲，平均年齡為 38．4 歲；女 34 例，年齡 30～58 歲，平均年齡為 37．5 歲；對照組：男 23 例，年齡 24～65 歲，平均年齡為 36．2 歲；女 27 例，年齡 25～64 歲，平均年齡為36．8歲。居住地分布在全省，主要來源于畜牧業(yè)發(fā)達的農村地區(qū)，各地區(qū)之間無顯著差異。臨床診斷以衛(wèi)生部地方病防治司頒布的布病診斷標準為依據(jù)。參考文獻[4]臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、高燒，伴有關節(jié)疼痛和肝脾腫大。

1．2 試驗方法

1．2．1 細菌的分離與培養(yǎng) 使用法國梅里埃公司的全自動血培養(yǎng)儀Bacd/Alert 60進行門診和住院疑似布病患者血液樣本分離培養(yǎng)。具體操作如下：取來自于臨床門診和住院的疑似布病患者的靜脈血8～10ml，接種至血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。若有陽性報警，再轉種至血瓊脂平板培養(yǎng)。最后再使用法國梅里埃公司的全自動細菌鑒定儀VITEK-2進行菌株鑒定。

1．2．2 虎紅平板凝集試驗(RBPT)采取臨床上門診和住院的疑似布病患者以及健康體檢者的靜脈血1～2ml，待血液凝固后，室溫 2500r/min 離心 15min，獲取血清。取干凈的玻片或者有凹型孔的玻片，向玻片上分別加30μl待檢血清和30μl虎紅平板凝集抗原，充分混勻抗原和血清，5min內判定結果。出現(xiàn)肉眼可見的凝集顆粒則判斷為陽性，記為（+）；未見凝集顆粒則判定為陰性（-）。每次試驗均設陽性和陰性對照。

1．2．3 試管凝集試驗（SAT） 取5支小試管，向第1管加入2．3ml生理鹽水，向第2到5管各加入生理鹽水 0．5ml，將 0．2ml被檢血清加入第 1 管中，充分混勻后取0．5ml至第2管并棄掉1．5ml， 充分混勻后，從第2管中取0．5ml至第3管，以此類推至第5管，第5管充分混勻后棄掉0．5ml。每管含稀釋的血清均為0．5ml。然后再向第1到5管中各加入10倍稀釋的試管凝集抗原 （布魯桿菌菌體抗原）0．5ml，最后每管反應體積為1ml；待檢血清稀釋度從第 1～5 管分別為：1：25、1：50、1：100、1：200 和1：400。充分振蕩混勻后，將試管置于37℃溫箱孵育20～22h，然后與標準的濁度管進行對比判定結果。待檢血清效價在1∶100(++)及以上者為陽性，1：50（+）為可疑，以下則為陰性。

1．2．4 間接酶聯(lián)免疫吸附試驗 (iELISA)人布魯菌病IgG(Brucellosis IgG)間接ELISA檢測試劑盒由上海美旋生物科技有限公司銷售的德國IBL產(chǎn)品，編號：RE56821。操作方法按照試劑盒說明書進行，結果判定標準：陽性：＞12U/ml，可疑 8～12U/ml，陰性＜8U/ml。標準品陰性質控：A為1U/ml，臨界質控：B 為 10U/ml，弱陽性質控：C 為 50U/ml，陽性質控：D 為 200U/ml。

1．3 統(tǒng)計學處理 使用 SPSS 18．0 將 RBPT、SAT、iELISA、血培養(yǎng)的檢測結果進行處理，運用卡方檢驗進行統(tǒng)計學分析，P＜0．05時差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 細菌學檢測 142例門診和住院的疑似布病患者血培養(yǎng)結果均為陽性，健康對照組血培養(yǎng)結果均為陰性。血培養(yǎng)4～5d后開始陽性報警，接種至血瓊脂平板上生長緩慢，2d后開始出現(xiàn)針尖樣大小的菌落。革蘭染色為陰性短小球桿菌，經(jīng)全自動細菌鑒定儀VITEK-2鑒定后為馬爾他布魯菌（Br.melitensis）。

2．2 血清學檢測 142例門診和住院的疑似布病患者血清虎紅平板凝集試驗檢測結果為：139例陽性，3例陰性，健康對照組血培養(yǎng)結果均為陰性，和血培養(yǎng)結果比較無顯著差異（P＞0．05）。經(jīng)試管凝集試驗檢測結果為：135例陽性，7例陰性，健康對照組均為陰性，與血培養(yǎng)結果比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。人布魯氏菌病 IgG 檢測結果為 137例陽性，5例陰性，健康對照組均為陰性，與血培養(yǎng)結果比較，差異不顯著（P＞0．05）（表 1）；對 3 種布病常規(guī)血清學檢測方法的結果進行兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。

3 討論

布魯桿菌病的診斷方法較多，包括病原學、血清學、生物化學和分子生物學等技術。其中布魯桿菌的分離鑒定即病原學檢測是布病診斷的金標準，但其具有耗時長、檢出率低、培養(yǎng)條件苛刻、費時費力、方法復雜、實驗室操作具有潛在的危險性等缺點[10-12]；因此，臨床上布病的診斷以血清學檢測技術為主。布魯桿菌侵入機體后會不斷地刺激機體產(chǎn)生凝集性抗體、補體結合抗體、調理素和沉淀抗體等，檢測血清抗體對診斷病情具有重要的意義，但是該檢測方法不能區(qū)別自然感染抗體、免疫抗體以及一些非布魯桿菌的感染 （如耶爾辛氏菌0：9產(chǎn)生的抗體）。當前已有多種布病的血清學檢測技術，且各具特色，但是都存在一定的局限性，至今仍然缺乏一種具備特異性、敏感性、檢測時間短、操作簡單的血清學檢測方法[13，14]。目前，國內使用較多的布病檢測方法有RBPT、SAT、iELISA以及全血培養(yǎng)等[15，16]。其中RBPT檢測特異性低、結果易受測試溫度和凝集時間短和人為主觀判斷等因素影響，不易做出準確的診斷，主要用于初篩。SAT是布病診斷的標準方法，主要用于定性。RBPT和SAT檢測的抗體主要是IgM，而當人體感染布魯桿菌后產(chǎn)生最多并且持續(xù)時間最長的是IgG抗體，因此這兩種檢測方法容易受到體內其他IgM抗體的影響。本研究對142例在2014年1月至2016年4月來我院門診和住院的疑似布病患者以及健康對照組的血清樣本進行了細菌學和常規(guī)血清學的檢測。患者血培養(yǎng)結果為全陽性，健康對照組為全陰性；使用RBPT檢測出陽性139例、陰性3例，健康對照組為全陰性，兩種檢測方法具有較高的符合率；該結果可能是由于RBPT可以同時檢測IgG和IgM抗體，使其具有較高的陽性檢出率。而SAT檢測結果具有較高的假陰性率：135例陽性，7例陰性，其原因可能是與患者的疾病進程有關，疾病已過急性期，患者血清中的IgM已消失。本研究中使用的人布魯菌病IgG(Brucellosis IgG)間接ELISA檢測方法正好彌補了該缺點，檢出137例陽性和5例陰性；較SAT具有較高的陽性檢出率，與血培養(yǎng)結果具有較高的符合率。但是，由于人感染布魯桿菌后首先體內產(chǎn)生的是IgM抗體，使用該檢測方法則容易漏檢布病的感染初期。本研究中，RBPT、SAT和iELISA檢測結果與血培養(yǎng)檢測均具有較高的符合率，分別與血培養(yǎng)檢測結果比較差異不顯著（P＞0．05）。

表1 三種布魯桿菌病血清學檢測方法結果比較

因此，綜合以上檢測結果，本研究中布病的四種檢測方法各有優(yōu)缺點。臨床上只有將多種檢測方法相互結合和補充，使用不同檢測方法并將其結果進行復核，再結合流行病學和臨床癥狀做出正確的診斷，從而對布病患者進行正確的用藥和治療。同時，建議臨床上進行大規(guī)模的檢查和篩選時，先使用具有特異性、價格低廉、敏感性較高、操作簡單的檢測方法，然后再使用兩種或多種不同的檢測方法進行復核，然后再結合流行病學和臨床癥狀做出確診。

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