廣州市番禺區(qū)丙型肝炎患者病毒基因型與病毒載量的相關性分析

黃雪瓊，吳普昭，黃誠記

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 511400)

丙型肝炎病毒是一種經(jīng)血液傳播引起慢性肝臟疾病的RNA病毒，其核酸是單股、線性、正鏈RNA。由于HCV-RNA復制所依賴的聚合酶缺乏校正功能，HCV基因組呈現(xiàn)高度特異性[1]。根據(jù)不同區(qū)域的基因序列變異情況，HCV分為6個基因型和80多種基因亞型。不同HCV基因型感染者的臨床表現(xiàn)、肝病嚴重程度及慢性化病程進展均有差異，抗病毒治療的效果也不同[2]，近年來的研究表明，HCV的基因型與丙型肝炎的治療方案及治療周期關系密切[3，4]。本文通過統(tǒng)計分析番禺地區(qū)丙型肝炎患者病毒基因型及基因型與病毒載量的相關性，以了解本地區(qū)丙型肝炎患者的病毒基因型構成狀況及為個體化抗病毒治療方案提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1．1 研究對象 2016年在廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院門診和住院所有HCV-RNA陽性的丙型肝炎患者，共收集125例病例。

1．2 標本采集 空腹靜脈采血3ml，3000r/min離心5min；吸取上層血清立即檢測或置于1．5ml經(jīng)高溫高壓滅菌處理的EP管內(nèi)，-70℃保存待測。

1．3 儀器和試劑 ABI 7500 Real Time PCR system實時熒光PCR檢測儀，YN-H16分子雜交儀、GELDOCXR+凝膠成像分析儀。丙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒和丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒，均購于中山大學達安基因股份有限公司。

1．4 血清HCV-RNA定量檢測 嚴格按照丙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒操作說明書和實驗室操作規(guī)程對血清標本進行HCV-RNA定量檢測。

1．5 HCV 基因分型檢測

1．5．1 HCV-RNA提取 嚴格按照丙型肝炎病毒基因分型核酸提取試劑盒操作說明書提取血清標本HCV-RNA，并對已提取的病毒核酸溶液立即進行擴增。

1．5．2 RT-PCR擴增 取PCR反應管，加入反應試劑和30ul已提取的病毒核酸溶液，滴加礦物油后瞬時離心封閉。按反應條件進行擴增：50℃逆轉錄25min，95℃預變性 15min，94℃ 30s→ 55℃ 40s→72℃45s進行45個循環(huán)擴增，最后72℃延伸7min。

1．5．3 雜交反應 將預先經(jīng)過 98℃變性 10min、隨后立即冰浴冷卻的PCR產(chǎn)物加入已放有雜交膜條的雜交管中，低速轉動（100～150r/min），50℃雜交60min。雜交完成后進行洗膜、顯色，用凝膠成像分析儀掃描記錄結果。結果如圖1。

圖1 HCV基因分型結果示意圖。

1．6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17．0軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料以表示，1b型與非1b型病人血清HCV-RNA載量比較采用t檢驗，1b型與非1b型低病毒載量水平與中高病毒載量水平的人數(shù)比例比較采用卡方檢驗。檢驗水準：a=0．05，以 P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 番禺區(qū)丙型肝炎患者丙肝病毒基因型構成狀況 125例HCV-RNA陽性樣本中，檢測出1b、2a、3a、3b、6a，5種基因型。其中1b型為比例最大的基因型，占 48．0%（60/125）；其次為 6a 型，占 27．2%（34/125）； 其余 2a 型占 8．0%（10/125），3a 型 占10．4%（13/125），3b 型占 6．4%（8/125）；詳見表 1。

表1 番禺區(qū)丙型肝炎患者HCV基因型構成狀況

2．2 丙肝病毒基因型與病毒載量的相關性

2．2．1 由于 1b 型占 48．0%，為本地區(qū)主要基因型，因此采取對1b型組和非lb型組之間HCV-RNA載量進行比較，結果 t=2．417，P＜0．05。 兩者病毒載量差異有統(tǒng)計學意義，1b型患者HCV-RNA載量高于非1b型患者，見表2。

表2 1b型與非1b型血清病毒載量的比較

2．2．2 按照血清HCV-RNA載量分為低病毒載量組＜105（log10 拷貝/ml）、中高病毒載量組＞105（log10拷貝/ml），1b型與非1b型例數(shù)及比例見表3。通過卡方檢驗比較低病毒載量組與中高病毒載量組病人比例，結果 χ2=4．159，P＜0．05，比較有統(tǒng)計學意義。在低病毒載量比較中1b型病人所占比例小于非1b型，中高病毒載量比較中1b型病人比例大于非1b型。

表3 1b型與非1b型在不同病毒載量水平的病例數(shù)比較

3 討論

全球約有1．3億～2．1億人感染丙型肝炎病毒(HCV)，我國一般人群HCV感染率為0．43%，約有1300萬人口抗-HCV陽性，是世界上HCV感染人口數(shù)最多的國家。丙肝病毒是肝細胞癌的主要危險因素之一，從全球范圍來看，至少有三分之一的肝細胞癌是由HCV引起的，每年約有35萬人死于丙肝相關疾病[5]，丙肝防治形勢嚴峻。

丙型肝炎病毒是單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒科。由于該病毒為RNA病毒，易發(fā)生基因變異，根據(jù)核苷酸同源性分析，HCV遺傳變異性可分為6種基因型，每組基因型又分別可以分為多種基因亞型。因地域不同，HCV基因型在不同地區(qū)存在很大差異，基因分型不僅有助于了解相關HCV演變及流行分布，也有助于了解丙型肝炎的危險因素以及肝臟疾病的進展情況，HCV基因分型在流行病學研究和臨床治療上均有重要作用[6]。廣州地區(qū)最廣泛流行的丙型肝炎病毒分型是1b型，其次為6a型，1b型也是全世界最主要的流行類型，和世界大流行的環(huán)境相似；1b型的丙型肝炎易形成慢性肝炎，不易根治，并有可能發(fā)展成肝癌，對社會的危害性大[7]。廣州地區(qū)6a型丙型肝炎病毒流行是因為毗鄰香港和澳門，以及東南亞等6a型分布廣泛的地區(qū)，這些地區(qū)的人口與廣州地區(qū)相互交流頻繁，使廣州地區(qū)6a型丙型肝炎流行呈逐漸增加趨勢。6a類型的丙型肝炎較容易治愈，不容易發(fā)展成慢性肝炎[8]。因此，檢測HCV基因型有助于判斷治療的難易程度、制定個體化的資料方案[9]。

番禺地區(qū)2016年收集的125例丙型肝炎病毒陽性患者當中，1b型為主要類型，占48．0%，肖桂娥等在廣州地區(qū)2014年檢測1b型比例為40．78%[10]，本次研究結果與廣州結果相近，也與廣東乃至全國平均水平相符。番禺地區(qū)丙型肝炎病毒基因6a型的比例達到了27．2%，高于全國平均水平，這是由于廣州番禺屬于東南沿海毗鄰香港，澳門以及東南亞6a類型廣泛流行的地區(qū)，人員交流頻繁導致。相比粵東地區(qū)2007-2010年6a型比例為17．9%，說明番禺與廣東其他地區(qū)情況類似但更為嚴重[11，12]。大量研究表明，1b型丙肝病毒導致的丙型肝炎在臨床上是較為難治的類型，這提醒我們番禺地區(qū)丙肝臨床治療形式不容樂觀。

由于本地區(qū)1b類型患者比例較大，且臨床上也較其他基因型容易轉變成為慢性丙肝難以治愈，因此我們主要研究1b型與非1b型之間的病毒載量差異[13，14]。通過獨立樣本t檢驗，比較1b型與非1b型患者血清HCV-RNA載量，結果顯示1b型與非1b型病毒載量之間差異性有統(tǒng)計學意義，1b類型的丙型肝炎病毒載量平均值為5．87±1．05（log10拷貝/ml）， 高于非 1b類型的平均值 5．36±1．34（log10 拷貝/ml）；另外通過對 1b 型與非 1b 型患者血清HCV-RNA在低病毒載量水平與中高病毒載量水平的人數(shù)比例作比較，用卡方檢驗顯示1b型患者中高病毒載量水平的人數(shù)比例大于非1b型。從患者血清病毒載量方面反映番禺地區(qū)1b類型的丙型肝炎病人的病情要比非1b類型的嚴重，與臨床上1b類型較難治愈和易形成慢性肝炎的臨床特點相符[15]。

本次研究，了解到廣州番禺地區(qū)丙型肝炎病毒基因型的構成特點和分析丙肝病毒基因型與病毒載量的相關性，結果提醒我們目前防治丙肝1b型形勢依然嚴峻，臨床應根據(jù)不同基因型病毒特點制定個體化治療方案。

[1]Simmonds P．Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus-15 years on．J Gen Virol 2004；85：3173-3188．

[2]Pawlotsky JM．Hepatitis C virus genetic variability：pathogenic and clinical implications．Clin Liver Dis 2003；7：45-66．

[3]劉劍榮，黃永建，夏洪嬌．萍鄉(xiāng)地區(qū)丙型肝炎基因分型[J]．實驗與檢驗醫(yī)學，2010，28(2)：141-142．

[4]桂亞萍，鄭惠，沃琤．九江地區(qū)丙型肝炎病毒基因分型[J]．實驗與檢驗醫(yī)學，2010，28(5)：514，480．

[5]潘華偉，苑遠．丙型肝炎病毒感染的流行病學研究進展[J]．吉林醫(yī)藥學院學報，2017，38(2)：123-126．

[6]蘇迎盈，劉慧鑫，汪寧．中國丙型肝炎病毒基因型分布[J]．中華流行病學雜志，2013，34(1)：80-84．

[7]李偉琴，徐光華，吳殿磊，等．丙型肝炎基因分型進展及其臨床意義[J]．世界華人消化雜志，2009，17(6)：589-593．

[8]蘇明華，江建寧．丙型肝炎病毒基因6型感染的流行病學和治療進展[J]．實用肝臟病雜志，2016，19(4)：497-500．

[9]Hnatyszyn HJ．Chronic hepatitis C and genotyping：The clinical significance ofdetermining HCV genotypes． Antivir Ther，2005，10：1-11

[10]肖桂娥，魏紹靜，張復春，等．廣州地區(qū)丙型肝炎患者HCV基因分型研究[J]．熱帶醫(yī)學雜志，2014，14(5)：589-594．

[11]張瑞，杜紹財．丙型肝炎病毒基因分型的研究進展[J]．中華檢驗醫(yī)學雜志，2006，29(5)：469-471．

[12]黃敬彬，柯楚琴．粵東地區(qū)丙型病毒性肝炎患者的HCV基因型分型研究——附140例檢測分析[J]．新醫(yī)學，2012，43(2)：109-111．

[13]谷斌，黃慧琴，侯小蘭，等．郴州地區(qū)HCV基因型與病毒載量的相關性分析[J]．臨床肝膽病雜志，2013，29(11)：832-834．

[14]王潔．甘肅省隴南地區(qū)不同基因型HCV分布特征研究[J]．檢驗醫(yī)學與臨床，2014，11(17)：2364-2365．

[15]畢蔓茹，王曉韌，王威，等．黑龍江地區(qū)丙型病毒性肝炎病毒基因型與亞型的分布特點及臨床意義[J]．中國醫(yī)學前沿雜志(電子版)，2014(9)：30-32．