薄殼山核桃葉不同溶劑浸提物對高丹草的化感效應(yīng)比較

胡凌峰，孫虎，宋曰欽，韓修文

（黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041）

植物化感作用是指植物本身通過釋放次生代謝物質(zhì)到環(huán)境中，從而對一定范圍內(nèi)的植物（包括自身）產(chǎn)生直接或間接影響，是其自身化學(xué)調(diào)控和適應(yīng)環(huán)境的一種生態(tài)機(jī)制[1-3]。主要通過根、葉、花、果等不同器官的淋溶、揮發(fā)、腐解和分泌向自然界中釋放化感物質(zhì)，從而影響周圍環(huán)境中植物群落演替和個(gè)體生長發(fā)育[4]。農(nóng)林業(yè)中的化感作用普遍存在，是引起森林或耕地地力衰退、生產(chǎn)力下降的主要原因[5-6]。因此，國內(nèi)外眾多學(xué)者在篩選強(qiáng)化感潛勢新品種，利用不同植物間的正相互作用，進(jìn)行混作、間作、套作，建立植物間有益組合，改進(jìn)栽培布局，減少作物化感作用的負(fù)面影響等方面進(jìn)行了深入研究，并取得了重要進(jìn)展[5，7]。

近年來，我國農(nóng)林業(yè)發(fā)展目標(biāo)逐漸向建設(shè)具有長期穩(wěn)定性、可持續(xù)發(fā)展的農(nóng)林業(yè)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移[8]，所以根據(jù)不同植物之間化感作用來進(jìn)行合理的種間配置是發(fā)展的重要舉措之一。如果間作植物選擇不當(dāng)，可能就會(huì)產(chǎn)生植物之間的抑制作用，從而影響產(chǎn)量。李茜[9]等發(fā)現(xiàn)核桃葉水浸提液對白術(shù)幼苗生長表現(xiàn)出低促高抑的雙重質(zhì)量濃度效應(yīng)。韓志軍[10]等通過研究發(fā)現(xiàn)花椒葉浸提液隨著濃度的增加對大豆的生長抑制作用也越來越強(qiáng)。因此植物的化感作用也是影響合理布局搭配的重要因素之一[11]。

薄殼山核桃（Carya illinoensis），又名美國山核桃、長山核桃，是胡桃科山核桃屬植物，是世界上著名的干果樹種之一。其果實(shí)個(gè)大、殼薄、出仁率高，營養(yǎng)豐富，是理想的保健食品和面包糖果的添加材料[12]；同時(shí)又因其油脂含量高、材質(zhì)堅(jiān)韌、樹勢挺拔，也成為重要的木本油料植物和用材綠化樹種[8]。近年來，我國薄殼山核桃發(fā)展逐漸受到政府重視，并進(jìn)入商業(yè)化的栽培模式[13]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，胡桃科植物體內(nèi)多含有某些活性物質(zhì)，能對周圍環(huán)境中的植物生長起到抑制作用[14]，了解薄殼山核桃的化感作用機(jī)制對擴(kuò)大其栽培利用具有十分重要的作用。前人對薄殼山核桃化感作用的研究主要集中于不同器官水提液對植物生長的影響[13,15-17]和其本身的自毒作用[18]，在不同溶劑浸提葉片中的化感物質(zhì)的研究方面較少。高丹草作為一種新型的禾本科飼料植物，具有很強(qiáng)的再生能力和抗逆性，在畜牧業(yè)上有很高的應(yīng)用前景[19]。本文主要采用室內(nèi)種子發(fā)芽及幼苗生長試驗(yàn)，以此探究不同溶劑浸提薄殼山核桃葉片中活性物質(zhì)的化感作用，以期對薄殼山核桃葉這一豐富的生物資源的開發(fā)利用提供新途徑，并對其農(nóng)林復(fù)合經(jīng)營提供科學(xué)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于黃山學(xué)院天都園林苗圃地健康薄殼山核桃植株上采集新鮮葉片，洗凈，置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)陰干備用。選用健康飽滿的高丹草種子，先用1.0%高錳酸鉀浸泡15 min，再用蒸餾水沖洗3次備用。

1.2 試驗(yàn)方法

參考朱成磊[20]等的方法并進(jìn)行修改，取40 g葉片用200 mL80%甲醇浸提24 h，取上層清液保存。再向沉淀物中加入200 mL80%甲醇浸提24 h，取兩次獲得的上清液于35℃下?lián)]干，加蒸餾水定容至100 mL，得到濃度為0.25 g/mL母液。將母液加入分液漏斗中，先加入200 mL石油醚溶液浸提12 h后收集上清液保存，于35℃條件下?lián)]干，加入去離子水定容至100 mL配成濃度為0.25 g/mL的溶液，即為石油醚態(tài)液相(石油醚相)；向母液中加入等量三氯甲烷溶液，操作方法同上，得到三氯甲烷態(tài)液相(三氯甲烷相)；再以此方法得到乙酸乙酯態(tài)液相(乙酸乙酯相)以及甲醇態(tài)液相(甲醇相)。將各組溶液加入燒杯中封口，置于4℃冰箱保存。

在培養(yǎng)皿(Φ=9 cm)底部鋪兩層濾紙，向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入10 mL各組溶液，并以相同體積的純水作為對照組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子，置于25℃恒溫光照培養(yǎng)中培養(yǎng)。6 d后計(jì)算各組發(fā)芽指標(biāo)，測量植株根長、莖長、鮮重、可溶性蛋白含量各因素的抑制指數(shù)。

可溶性蛋白質(zhì)含量測定：采用Bradford solution法。利用牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測量并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取 10 μL待測樣品加入 100 μL Bradford solution溶液混勻，靜置10 min，于紫外線分光光度計(jì)595 nm波長下進(jìn)行測定，每組重復(fù)3次，記錄數(shù)據(jù)，求取平均值。

2 數(shù)據(jù)收集及處理

規(guī)定播種后一天為播種起始天數(shù)，記錄種子發(fā)芽情況，以種子生長長度超過種子半徑為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算種子發(fā)芽率，發(fā)芽勢。

種子發(fā)芽率（%）＝正常發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100

種子發(fā)芽勢（%）＝日平均發(fā)芽數(shù)達(dá)到最高日正常發(fā)芽的種子總數(shù)/供試種子數(shù)×100

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt

平均發(fā)芽速度=∑GtDt/∑Gt

式中：Gt為在第t天的種子發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)種子發(fā)芽所用的時(shí)間。

采用Williamson[21]等提出的敏感指數(shù)RI作為衡量化感強(qiáng)度的指標(biāo)：RI=1-C/T(當(dāng) T≥C)：RI=T/C-1(當(dāng)T＜C)，其中C是對照值，T是處理值，RI則代表化感效應(yīng)，當(dāng)RI＞0時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，當(dāng)RI＜0時(shí)表現(xiàn)為抑制作用，RI的絕對值代表作用強(qiáng)度的大小。

用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄、數(shù)據(jù)處理和圖表繪制；用SPSS17.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

3 結(jié)果分析

3.1 薄殼山核桃葉片不同溶劑提取物對高丹草種子發(fā)芽的影響

由表1、表2可知，不同提取物處理對種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽速度有一定的差異。甲醇相組對種子發(fā)芽率影響最大，相比于對照組降低了12.00%，差異極顯著，抑制指數(shù)達(dá)到0.13。石油醚相和乙酸乙酯相的發(fā)芽率比對照組低10.00%和9.33%，差異顯著，抑制指數(shù)分別達(dá)到0.11、0.10；甲醇相對種子的發(fā)芽勢起抑制作用，比對照組降低了6.00%，呈極顯著差異，抑制指數(shù)達(dá)到0.13；乙酸乙酯相和甲醇相種子的發(fā)芽指數(shù)為37.82、33.58，與對照組之間呈極顯著差異，抑制指數(shù)分別達(dá)到0.13、0.23。各處理組間種子的平均發(fā)芽速度并無差異。各相態(tài)對高丹草種子發(fā)芽影響抑制指數(shù)從大到小的排列依次為：甲醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞氯仿相。

表1 薄殼山核桃葉不同溶劑浸提物對高丹草發(fā)芽的影響

表2 薄殼山核桃葉不同溶劑浸提物對高丹草種子發(fā)芽諸因子的抑制指數(shù)

3.2 薄殼山核桃葉不同溶劑提取物對高丹草幼苗生長的影響

3.2.1 不同溶劑提取物對高丹草幼苗鮮重的影響

由表3可知，甲醇相組植株鮮重比對照組降低了0.009 g，抑制指數(shù)為0.13，與對照組之間差異不顯著。石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相的植株鮮重比對照組分別高出 0.022 g、0.011 g、0.010 g，促進(jìn)指數(shù)分別為0.32、0.16、0.15，與對照組相比差異顯著。說明石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相3組提取液對高丹草的鮮重物質(zhì)積累有顯著促進(jìn)作用。各相態(tài)對高丹草植株鮮重物質(zhì)積累抑制指數(shù)的影響從大到小排列依次為：甲醇相＞乙酸乙酯相＞氯仿相＞石油醚相。

3.2.2 不同溶劑提取物對高丹草幼苗莖長、根長生長的影響

從表4可知，石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相提取液處理組植株莖長高于對照組，說明這3種溶劑提取物對高丹草的莖生長有促進(jìn)作用。甲醇相組植株莖生長長度低于對照組，說明甲醇相提取物對高丹草莖的生長有抑制作用。石油醚相、乙酸乙酯相處理組植株莖長比對照組分別高出1.13 cm、0.47 cm，促進(jìn)指數(shù)分別為0.15、0.06，與對照組之間差異不顯著。氯仿相組植株莖長比對照組高出1.57 cm，促進(jìn)指數(shù)為0.21，與對照組之間差異顯著。甲醇相組植株莖長比對照組低4.55 cm，抑制指數(shù)為0.61，與對照組之間差異極顯著。說明甲醇相提取液對高丹草莖長生長有極顯著的抑制作用；氯仿相提取液對高丹草的莖長生長有顯著促進(jìn)作用；石油醚相、乙酸乙酯相提取液對高丹草的莖生長作用不明顯。各相態(tài)對高丹草莖長生長的抑制指數(shù)的影響從大到小排列依次為：甲醇相＞乙酸乙酯相＞石油醚相＞氯仿相。

表3 薄殼山核桃葉不同溶劑浸提物對高丹草鮮重的影響

由表4可知，石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相提取液處理組植株根長高于對照組，說明這3種溶劑提取物對高丹草的根長生長有促進(jìn)作用。甲醇相組植株根生長長度低于對照組，說明甲醇提取物對高丹草根生長有抑制作用。石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相處理組植株根生長量比對照組分別高出1.78 cm、1.26 cm、1.04 cm，促進(jìn)指數(shù)分別為 0.48、0.34、0.28，與對照組之間差異極顯著。甲醇相組植株根生長長度比對照組低1.15 cm，抑制指數(shù)為0.31，與對照組之間差異顯著。說明石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相提取液對高丹草根生長有極顯著的促進(jìn)作用；甲醇相提取液對高丹草根生長有顯著的抑制作用。各相態(tài)對高丹草根長度生長抑制指數(shù)的影響從大到小排列依次為：甲醇相＞乙酸乙酯相＞氯仿相＞石油醚相。

3.2.3 薄殼山核桃葉不同溶劑提取物對高丹草體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)合成的影響

可溶性蛋白對植物細(xì)胞的生命物質(zhì)和生物膜起到保護(hù)作用，是植物抗逆性指標(biāo)之一。由表5可知，石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、甲醇相組高丹草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白合成量比對照組分別下降了 0.269 mg/g、0.253 mg/g、0.299 mg/g、0.283 mg/g，抑制指數(shù)分別達(dá)到了 0.75、0.71、0.84、0.79，與對照組幼苗中可溶性蛋白質(zhì)含量成極顯著差異。石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、甲醇相提取液處理組植株幼苗體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)合成量遠(yuǎn)低于對照組，說明這4種溶劑提取物對高丹草體內(nèi)可溶性蛋白的合成起到一個(gè)抑制作用。各相態(tài)對高丹草幼苗體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)合成量抑制指數(shù)的影響從大到小排列依次為：乙酸乙酯相＞甲醇相＞石油醚相＞氯仿相。

表4 薄殼山核桃葉不同溶劑浸提物對高丹草胚軸的影響

4 結(jié)論與討論

大量研究證明，化感物質(zhì)隨著其種類、濃度、外界環(huán)境以及受供體植物的不同作用其機(jī)理也存在著多樣性[22-23]。單一化感物質(zhì)的作用機(jī)理主要是影響受體植物種子萌發(fā)、物質(zhì)代謝中的關(guān)鍵酶活性、降低光合效率、損傷細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性等[22]。Rice按照化學(xué)結(jié)構(gòu)把化感物質(zhì)分為15類[24]，但目前認(rèn)為化感物質(zhì)主要分為酚類、萜類、糖和糖苷類、生物堿和非蛋白氨基酸，其中酚類和萜類分別具有水溶性和揮發(fā)性，是高等植物的主要化感物質(zhì)[13,22]。本試驗(yàn)使用薄殼山核桃葉片作為供試材料，利用相似相溶原理，使用極性大小不同的有機(jī)溶劑（石油醚相＜氯仿相＜乙酸乙酯相＜甲醇相）將葉片中的化感物質(zhì)進(jìn)行提取。通過觀察比較不同相態(tài)組對高丹草種子發(fā)芽影響和其幼苗生長，驗(yàn)證了薄殼山核桃葉中含有一定的化感物質(zhì)。

孔垂華[25]等和張權(quán)[15-16]等通過研究發(fā)現(xiàn)，化感作用通過對植物種子發(fā)芽情況和生長情況來表現(xiàn)，且對于不同受體植物產(chǎn)生的化感作用程度也不一樣。本試驗(yàn)表明，不同相態(tài)組處理對高丹草種子發(fā)芽生長情況影響不同。甲醇相、石油醚相、乙酸乙酯相對種子的發(fā)芽率都有顯著抑制作用，且抑制指數(shù)都高于10%；4種溶劑提取液對種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)都有一定的影響。其中甲醇相對種子發(fā)芽率、種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)有極顯著抑制作用，乙酸乙酯相對種子發(fā)芽指數(shù)有極顯著抑制作用；試驗(yàn)中甲醇相處理組對高丹草幼苗的莖長、根長以及鮮重有一定程度的抑制作用，其余相態(tài)組對這幾個(gè)指標(biāo)都有不同程度的促進(jìn)作用，說明甲醇浸提萃取薄殼山核桃葉片中的化感物質(zhì)對高丹草的種子萌發(fā)和幼苗生長影響較大。其原因可能是因?yàn)榛形镔|(zhì)普遍具有“低促高抑”的現(xiàn)象，隨著溶劑極性的增大，其中溶解的化感物質(zhì)增多，多種化感物質(zhì)之間產(chǎn)生加合協(xié)同作用[23]，從而引起乙酸乙酯相和甲醇相對高丹草生長發(fā)育有顯著的抑制作用，而石油醚相和氯仿相卻起一定的促進(jìn)作用。這與王大力[27-28]等對豚草的化感作用和朱成磊[20]等對楊梅鮮葉的化感效應(yīng)方面的研究有相似之處。

通過測定高丹草幼苗中可溶性蛋白含量發(fā)現(xiàn)，4種相態(tài)的幼苗中的可溶性蛋白含量極顯著低于對照組，說明薄殼山核桃中化感物質(zhì)對高丹草中蛋白質(zhì)合成有極強(qiáng)的抑制作用，蛋白質(zhì)含量降低表明植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻，影響了植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成代謝[29]。孫延杰等[30]通過對不同化感物質(zhì)對五爪金龍的作用研究發(fā)現(xiàn)：由于化感物質(zhì)的影響，植物體內(nèi)主要涉及信號傳導(dǎo)、能量合成與代謝抗氧化及與基因轉(zhuǎn)錄等這些主要功能的蛋白質(zhì)表達(dá)量均發(fā)生了改變，但具體的改變途徑和表達(dá)方式還需要根據(jù)不同植物、不同條件進(jìn)行深入研究，推測不同種類的蛋白質(zhì)合成與表達(dá)變化是不同溶劑薄殼山核桃葉浸提液引起高丹草幼苗生長產(chǎn)生化感效應(yīng)的生理機(jī)制之一。

表5 薄殼山核桃葉不同溶劑浸提物對高丹草幼苗內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)合成的影響

研究薄殼山核桃葉不同溶劑浸提液的化感作用，對薄殼山核桃和不同植物間作的科學(xué)耕種有一定現(xiàn)實(shí)意義。作為一種多用途樹種[8,12]，薄殼山核桃有著極大的開發(fā)利用潛力，因此合理的對薄殼山核桃進(jìn)行栽培和管理，減弱或消除彼此作物間的抑制作用，才能更好地提高產(chǎn)量，增加收益。本試驗(yàn)是在室內(nèi)環(huán)境下完成的，對揭示薄殼山核桃葉片的化感作用有一定的理論價(jià)值，但應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐還需要根據(jù)栽植地的環(huán)境地理?xiàng)l件、間作物種類等實(shí)際情況來確定。因此，如何更好地消除薄殼山核桃的化感作用還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)探究。

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