煤塵誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和氧化損傷水平研究

周 勇，張紅梅，何軍山，劉 瑜

（1.湘南學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 郴州 423000；2.郴州市疾病預(yù)防控制中心，湖南 郴州 423000）

塵肺是全球分布最廣的職業(yè)病，是指因吸入生產(chǎn)性粉塵所致的肺泡功能損傷為主的慢性進(jìn)行性疾病，潛伏期短者幾年，長者可超過20年，病情進(jìn)展不可逆轉(zhuǎn)，即使脫離粉塵作業(yè)仍可繼續(xù)發(fā)生發(fā)展，其早期表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞肺泡炎，晚期導(dǎo)致不同程度的肺纖維化。塵肺病是我國發(fā)病人數(shù)最多，危害最嚴(yán)重的一種職業(yè)病，每年新發(fā)病例占各類職業(yè)病總數(shù)的80%以上[1]，對塵肺病的預(yù)防與控制是公共衛(wèi)生領(lǐng)域一個(gè)重要的研究方向。由于塵肺的纖維化病理改變是不可逆性的，而且目前缺乏有效的治療手段，研究生產(chǎn)性粉塵導(dǎo)致的肺泡巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)及其與接塵工人健康損害的關(guān)系，對于塵肺的發(fā)生機(jī)制的闡明、早期診斷、預(yù)防及治療具有重要的意義。

煤工塵肺一直是主要的職業(yè)病[2-3]，大批正處于勞動力旺盛時(shí)期的勞動者由于患病而基本喪失勞動能力，不得不提前結(jié)束職業(yè)生涯。因此，我們開展本次研究，為尋找生產(chǎn)性粉塵對健康危害的早期生物標(biāo)志物提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以期為更好的預(yù)防塵肺提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 生產(chǎn)性粉塵的采集 煤塵采自于某涉塵企業(yè)作業(yè)工作點(diǎn)。通過多級顆粒物采樣器選擇粒徑小于5 μm的粉塵（呼吸性粉塵）染毒巨噬細(xì)胞，將染毒的巨噬細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞空白組作為對照組。

1.2 主要試劑 RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液（Gibco）、胎牛血清（Sigma）、佛波酯（Sigma）、二甲基亞砜（Sigma）、細(xì)胞活力的檢測試劑盒（MTT法）、IL-lβ、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子ELISA試劑盒（酶聯(lián)科技）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、染毒與測定 選擇THP-1單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并通過佛波酯（PMA）刺激THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)其分化為人肺泡巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為4組，染毒劑量參考相關(guān)研究[4]，分別為：對照組，2 000 μg/ml組（高劑量組），1 000 μg/ml組（中劑量組）和500 μg/ml組（低劑量組），每組10個(gè)樣本，染毒8 h。ELISA法分別測定IL-lβ、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子水平。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。粉塵中游離二氧化硅含量的測定采用焦磷酸質(zhì)量法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表示各指標(biāo)平均位置和離散程度。樣本均數(shù)之間的比較使用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞活力的檢測結(jié)果 染毒8 h后，不同濃度的煤工粉塵均導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活力下降，隨著粉塵濃度的升高，細(xì)胞活力下降越為明顯，組與組之間的細(xì)胞活力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示具有一定劑量反應(yīng)關(guān)系，見表1。

表1 煤工粉塵染毒8 h對巨噬細(xì)胞活力的檢測結(jié)果（Table1 Result of the vitality of macrophages by coal dust exposure

表1 煤工粉塵染毒8 h對巨噬細(xì)胞活力的檢測結(jié)果（Table1 Result of the vitality of macrophages by coal dust exposure

?

2.2 巨噬細(xì)胞釋放IL-lβ的檢測結(jié)果 與對照組比較，不同濃度的粉塵在染毒8 h后，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放IL-lβ的呈升高趨勢，高劑量組釋放的IL-lβ水平最高（867.90 pg/ml），不同劑量組之間的IL-lβ水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 煤工粉塵染毒8h誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放IL-lβ的檢測結(jié)果Table2 Result of IL-lβ release from macrophages induced by coal dust exposure

表2 煤工粉塵染毒8h誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放IL-lβ的檢測結(jié)果Table2 Result of IL-lβ release from macrophages induced by coal dust exposure

?

2.3 巨噬細(xì)胞釋放IL-6的檢測結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組的IL-6水平均較對照組高（P＜0.05），且隨著染毒劑量的增高，IL-6的釋放量逐漸增多，呈現(xiàn)明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，見表3。

2.4 巨噬細(xì)胞釋放TNF-a的檢測結(jié)果 煤工粉塵作用于巨噬細(xì)胞后誘導(dǎo)其釋放出TNF-a的水平升高，并隨著粉塵濃度的增加而逐漸上升，低中高劑量組分別為66.71、149.96和249.86 pg/ml，呈現(xiàn)明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，見表4。

表3 煤工粉塵染毒8 h誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放IL-6的檢測結(jié)果（Table3 Result of IL-6 release from macrophages induced by coal dust exposure

表3 煤工粉塵染毒8 h誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放IL-6的檢測結(jié)果（Table3 Result of IL-6 release from macrophages induced by coal dust exposure

?

表4 煤工粉塵染毒8h誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的檢測結(jié)果Table4 Result of TNF-α release from macrophages induced by coal dust exposure

表4 煤工粉塵染毒8h誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α的檢測結(jié)果Table4 Result of TNF-α release from macrophages induced by coal dust exposure

?

3 討論

生產(chǎn)性粉塵中以可呼吸性粉塵（粒徑＜5 μm）對健康損害作用最強(qiáng)，經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺泡后，通過激活肺泡巨噬細(xì)胞聚集、吞噬粉塵，啟動氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)，最后發(fā)展為纖維化。隨著細(xì)胞分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)游離二氧化硅粉塵導(dǎo)致的氧化活性和免疫炎性反應(yīng)是造成機(jī)體損傷的關(guān)鍵因素[5]，其表面的自由基作用于巨噬細(xì)胞，啟動細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動性降低、通透性增高，細(xì)胞受損，進(jìn)而細(xì)胞死亡、破裂。肺泡巨噬細(xì)胞受損后，可釋放多種細(xì)胞因子[6]，這些因子參與炎性反應(yīng)及纖維化過程的調(diào)控，促進(jìn)組織修復(fù)，但過度的炎性反應(yīng)可直接或間接損傷肺組織，最終導(dǎo)致纖維化的發(fā)生。

生產(chǎn)性粉塵誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子因子類型眾多[7]，有研究顯示，人巨噬細(xì)胞在分別被陶瓷廠、鎢礦和錫礦的粉塵染毒后，將會釋放不同水平的IL-lβ、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子，并且釋放水平和不同類型粉塵的游離二氧化硅含量以及化學(xué)成分有關(guān)[8]。本次研究選擇的是粒徑＜5 μm的煤塵對巨噬細(xì)胞染毒，也以IL-lβ、IL-6、TNF-α作為綜合反映肺泡巨噬細(xì)受損后的指標(biāo)，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，觀察煤塵誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和氧化損傷水平。

結(jié)果顯示，煤塵對巨噬細(xì)胞染毒后，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子水平升高，均明顯高于對照組（P＜0.05）。且隨著染毒劑量的加大，細(xì)胞因子水平的改變越為明顯，2 000 μg/ml組（高劑量組）產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子水平最高，呈現(xiàn)較為明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。有研究表明，在眾多的細(xì)胞因子中，IL-6和TNF-α具有明顯的致纖維化作用[9]，說明在游離性二氧化硅引發(fā)煤工塵肺纖維化的反應(yīng)中，IL-6、TNF-α是起著關(guān)鍵性作用。

也有研究指出，TNF-α和IL-6兩種細(xì)胞因子并不是由生產(chǎn)性粉塵直接作用于巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的，而是石英誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β后，由IL-1β引發(fā)的后續(xù)炎性反應(yīng)[10]。阻斷IL-1β可明顯減弱纖維化反應(yīng)，IL-1β可能是石英誘發(fā)的炎性反應(yīng)向纖維化轉(zhuǎn)化的中心環(huán)節(jié)[11]。本次的研究結(jié)果顯示，IL-lβ的水平與IL-6、TNF-α的變化趨勢一致，隨著染毒劑量的增高而增高，也存在劑量反應(yīng)關(guān)系。但幾種細(xì)胞因子之間的關(guān)系，以及在煤工塵肺發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)一步定位，還有煤塵游離二氧化硅含量和化學(xué)成分對于巨噬細(xì)胞的影響是否和其他類型的粉塵存在不同，有待深入研究。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部.衛(wèi)生部通報(bào)2010年職業(yè)病防治工作情況和2011年重點(diǎn)工作[R].職業(yè)衛(wèi)生,2011,7:31.

[2] 李曉峰,張紅梅,廖春香.2008-2012年郴州市塵肺病初次診斷病例分析[J].職業(yè)與健康,2013,29(23):3107-3109.

[3] 張紅梅.郴州市140例農(nóng)民工煤工塵肺病人體檢結(jié)果分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇,2007,13(11):976-978.

[4] Jalava P,RO Salonen,AI Halinen,et al.Effects of sample preparation on chemistry,cytotoxicity,and inflammatory responses induced by air particulate matter[J].Inhal Toxicol,2005,17(2):107-117.

[5]Maeda M,Y Nishimura,N Kumagai,et al.Dysregulation of the immune system caused by silica and asbestos[J].J Immunotoxicol,2010,7(4):268-278.

[6] Zhai R,X Ge,H Li,et al.Differences in cellular and inflammatory cytokine profiles in the bronchoalveolar lavage fluid in bagassosis and silicosis[J].Am J Ind Med,2004,46(4):338-344.

[7] 曹明強(qiáng),馬興銘,廖萍泰,等.矽肺患者血清細(xì)胞因子和氧化損傷水平檢測[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2013,29(4):424-425.

[8] 周婷.生產(chǎn)性粉塵致巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)及其與接塵工人健康損害的關(guān)系[D].武漢:華中科技大學(xué),2012.

[9] Lang DS,H Schocker,S Hockertz.Effects of crocidolite asbestos on human bronchoepithelial-dependent fibroblast stimulation in coculture:the role of IL-6 and GM-CSF[J].Toxicology,2001,159(1-2):81-98.

[10]O'Hara AFL,Lim DJ,Mazzatti,et al.Stimulation of inflammatory gene expression in human preadipocytes by macrophage-conditioned medium:upregulation of IL-6 productionbymacrophage-derivedIL-1beta[J].Mol Cell Endocrinol,2012,349(2):239-247.

[11]Dinarello CA.A clinical perspective of IL-1 beta as the gatekeeper of inflammation[J].Eur J Immunol,2011,41(5):1203-1217.