分子印跡聚合物固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中11種氨基糖苷類藥物殘留

黃原飛 婁曉祎 周 哲 汪 洋 孔 聰 黃冬梅 蔡友瓊 于慧娟*

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品風(fēng)險評估實驗室(上海) ， 上海 200090) 2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院, 上海 201306) 3(賽默飛世爾科技(中國)有限公司, 上海 201206)

1 引 言

氨基糖苷類化合物(Aminoglycosides，AGs)是由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而成的苷類堿性抗生素，廣泛用于防治各種動物性疾病; 也常作為飼料添加劑，用于促進動物生長發(fā)育[1,2]。研究表明，AGs存在一定程度的耳毒性、腎毒性和神經(jīng)肌肉阻滯作用[3,4]。因此，世界各國均建立了AGs在動物源性食品中的相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。如歐盟[5]規(guī)定鏈霉素在豬肝臟、肌肉中的最高殘留限量(MRL)為500 μg/kg， 在乳品中的MRL為200 μg/kg; 我國農(nóng)業(yè)部235號公告[6]規(guī)定牛、豬的肌肉中鏈霉素、雙氫鏈霉素和新霉素的MRL分別為600、600 和500 μg/kg。

AGs的測定方法主要有微生物法[7]、免疫分析法[8]、液相色譜法(LC)[9,10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11～14]等。其中LC-MS/MS法由于抗背景干擾能力強、靈敏度高，應(yīng)用最為廣泛。目前對AGs測定方法的研究主要集中在蜂蜜[11]、牛奶[12]、動物內(nèi)臟和肌肉[13]等方面，針對水產(chǎn)品基質(zhì)的研究較少，且存在同時測定的藥物種類少、靈敏度不高、通用性不強等不足。高玲等[15]建立了水產(chǎn)品中5種AGs的檢測方法，方法定量限為10 μg/kg。Kaufmann等[16]建立了豬肉、牛肉和魚肉中13種AGs的測定方法，但未對蝦、蟹基質(zhì)進行相關(guān)研究。因此開發(fā)靈敏度高、適用于多種水產(chǎn)品基質(zhì)的AGs測定方法具有十分重要的意義。

分子印跡聚合物(MIP)固相萃取技術(shù)是利用分子印跡聚合物和模板分子在空間結(jié)構(gòu)的互補匹配對目標(biāo)物質(zhì)進行識別、富集的分離富集技術(shù)[17,18]。該技術(shù)對目標(biāo)化合物選擇性高，特異性結(jié)合能力強，能夠很好地消除基質(zhì)干擾，提高分析的準(zhǔn)確度和靈敏度[18,20]。

本研究以巴龍霉素、壯觀霉素、妥布霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素B、安普霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、丁胺卡那霉素和新霉素等11種AGs為研究對象，采用MIP固相萃取柱凈化，使用Obelisc R色譜柱，以甲酸-乙酸銨溶液和乙腈為流動相，實現(xiàn)了11種AGs的同時檢測。本方法靈敏度高且適用于魚、蝦、蟹等多種水產(chǎn)品基質(zhì)，為水產(chǎn)品中AGs的殘留監(jiān)管提供了技術(shù)支撐。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Ultimate 3000超高效液相色譜儀，配自動進樣器和柱溫箱(美國Thermo Fisher公司); TSQ Quantiva三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(美國Thermo Fisher公司); 16RXII 高速冷凍離心機(日本 HITACHI CF公司); Milli-Q超純水機(美國Millipore 公司); 固相萃取裝置(美國Supelco公司); PHS-3G pH計(上海儀電科學(xué)儀器公司)。Supel MIP Aminolycosides固相萃取柱(50 mg/3 mL，美國Supelco公司); Obelisc R色譜柱(100 mm×2.1 mm，5 μm，美國SIELC公司)。

慶大霉素(94.4%)、壯觀霉素(95.5%)、鏈霉素(99.0%)、卡那霉素(95.4%)、巴龍霉素(87.0%)、潮霉素B(79.3%)、安普霉素(81.5%)、妥布霉素(92.0%)、新霉素(90.0%)、丁胺卡那霉素(99.0%)、雙氫鏈霉素(99.0%)均購自德國Dr. Ehenstorfer公司。七氟丁酸(≥99.5%，美國Sigma公司); 乙腈、甲醇(色譜純，J.T.Baker公司); 甲酸(色譜純，F(xiàn)LUKA公司); 三氯乙酸(TCA)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、磷酸二氫鉀、乙酸銨、氨水、三氯甲烷均為分析純; 實驗用水由超純水儀(美國Millipore 公司)制備。

2.2 溶液的配制

稱取11種AGs標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg(精確至0.1 mg)，分別用水溶解并定容至10 mL，獲得1 g/L的單標(biāo)儲備液?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液以單標(biāo)儲備液稀釋配制而成，各組分濃度為: 巴龍霉素、卡那霉素、雙氫鏈霉素為0.4 μg/mL，安普霉素、丁胺卡那、壯觀霉素、妥布霉素、潮霉素B、慶大霉素、鏈霉素為1 μg/mL，新霉素為4 μg/mL。4℃避光儲存。氨基糖苷類化合物容易與玻璃發(fā)生吸附，實驗過程中應(yīng)盡量使用塑料容器[21]。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的配制: 取6份((2.00±0.01) g)空白樣品于50 mL塑料離心管中，分別加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.3節(jié)操作，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為: 巴龍霉素、卡那霉素、雙氫鏈霉素為1.0～100 μg/kg，安普霉素、丁胺卡那、壯觀霉素、妥布霉素、潮霉素B、慶大霉素、鏈霉素為2.5～250 μg/kg，新霉素為10.0～1000 μg/kg。

2.3 樣品前處理

2.3.1樣品制備在上海市農(nóng)貿(mào)市場隨機購買草魚(Ctenopharyngodonidellus)、南美白對蝦(PenaeusvannameiBoone)、河蟹(Eriocheirsinensis)，取可食部分，按照GB/T 30891-2014[22]的要求制樣， -18℃保存，實驗前解凍稱樣。

2.3.2提取稱取樣品2.0 g(精確到0.01 g)于50 mL塑料離心管中，加入10 mL 10 mmol/L磷酸鹽提取液(含0.4 mmol/L EDTA和2% TCA)，渦旋混勻后超聲提取10 min，10000 r/min離心10 min，移取上清液至另一塑料離心管中，殘渣按上述方法重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，用氨水調(diào)節(jié)至pH 7.0～7.5。取10 mL上清液，加入10 mL三氯甲烷，渦旋混勻后3000 r/min離心8 min，取上清液待凈化。

2.3.3凈化MIP固相萃取柱依次用1 mL甲醇、1 mL 50 mmol/L KH2PO4溶液活化，取5 mL待凈化液上樣后，依次用3 mL水、3 mL乙腈淋洗并抽干。加入3 mL 80%乙腈(含1%甲酸和5 mmol/L七氟丁酸)洗脫，收集洗脫液于45℃下氮氣吹干，殘渣用1 mL 75%乙腈(含1%甲酸和10 mmol/L乙酸銨)復(fù)溶，渦旋混勻后過0.22 μm有機濾膜，裝入帶有塑料內(nèi)襯管的進樣瓶中，待測。

2.4 儀器分析條件

2.4.1液相色譜分析條件色譜柱: Obelisc R柱(100 mm×2.1 mm，5 μm); 流動相: A為1%甲酸(V/V， 含2 mmol/L乙酸銨)，B為1%甲酸-乙腈(V/V，含2 mmol/L乙酸銨); 梯度洗脫程序: 0～3 min，90% B; 3～6 min，90%～5% B; 6～17 min，5% B; 17～17.1 min，5%～90% B; 17.1～26 min，90% B。流速0.3 mL/min; 柱溫30℃，進樣量20 μL。

2.4.2質(zhì)譜分析條件電噴霧離子源(ESI); 選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM); 正離子掃描; 噴霧電壓: 3500 V; 霧化溫度: 350℃; 離子傳輸管溫度: 325℃; 鞘氣: 40 arb; 輔氣: 5 arb。 11種AGs的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 11種AGs質(zhì)譜分析參數(shù)

Table 1 Mass spectrometry parameters for analysis of 11 kinds of aminoglycosides (AGs)

化合物Compound母離子Precursorion(m/z)子離子Productions(m/z)碰撞能量Collisionenergy(eV)透鏡電壓RFLens(V)巴龍霉素Paromomycin308．296壯觀霉素Spectinomycin351．182妥布霉素Tobramycin468．291慶大霉素Gentamycin478．330卡那霉素Kanamycin485．261潮霉素BHygromycinB528．261安普霉素Apramycin540．300鏈霉素Streptomycin582．270雙氫鏈霉素Dihydrostreptomycin584．300丁胺卡那霉素Amikacin586．330新霉素Neomycin615．330161．04?162．97333．11?207．11163．11?324．11322．18?157．11163．11?324．11352．04?177．11217．11?378．11263．04?246．04263．11?246．04425．15?264．04293．07?455．2212461946197522752363146314632163256716672285288526781778321593815930114371141884268423882188?：定量離子(Quantitativeion)。

3 結(jié)果與討論

3.1 液相色譜-質(zhì)譜分析條件的研究

3.1.1色譜柱的選擇AGs藥物極性強，分子中含有多個氨基和羥基，在C18柱上保留很弱。在流動相中添加離子對試劑(如七氟丁酸、五氟丙酸等)，利用其與AGs結(jié)合形成疏水型離子對，可延長AGs在C18柱上的保留時間。但離子對試劑極易殘留在液相色譜-質(zhì)譜儀內(nèi)，造成離子源污染和信號抑制[23]。

為避免使用離子對試劑，本研究根據(jù)AGs的性質(zhì)選擇了氨基柱(Luna-NH2和Thermo Amino)、親水柱(Waters Hilic)和混合型離子柱(Obelisc R)4種色譜柱，對11種AGs進行分離。實驗結(jié)果表明，Luna-NH2柱對壯觀霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素不保留; Thermo Amino柱對壯觀霉素不保留， 且鏈霉素、雙氫鏈霉素僅部分保留; 在Waters Hilic 柱上壯觀霉素不保留， 且新霉素峰形不好; Obelisc R 柱上各組分均能保留，峰形較好，且靈敏度高于其它色譜柱。因此，本研究選取Obelisc R 柱作為AGs檢測的色譜柱。

3.1.2流動相的優(yōu)化分別采用甲酸含量為0.1%、0.5%、1.0%和1.5%的水溶液和乙腈為流動相，考察甲酸濃度對色譜峰形和靈敏度的影響。結(jié)果表明，甲酸濃度為1%時，除壯觀霉素外, 其余各組分響應(yīng)值最高, 且色譜峰形最佳。在流動相中分別添加2、5、10和20 mmol/L乙酸銨增強壯觀霉素的保留性能。結(jié)果表明，2 mmol/L乙酸銨在增強壯觀霉素保留的同時，巴龍霉素、卡那霉素等組分靈敏度有所增高; 而隨著乙酸銨濃度升高，巴龍霉素、妥布霉素、安普霉素存在拖尾情況，且靈敏度下降。故最終采用1%甲酸(含2 mmol/L乙酸銨)-乙腈作為流動相。圖1為在最佳分析條件下11種AGs的標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子流圖。

3.2 樣品前處理方法的研究

圖1 11 種AGs標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 11 AGs

3.2.1固相萃取柱的選擇本研究采用磷酸鹽緩沖液(含0.4 mmol/L EDTA和2% TCA)提取水產(chǎn)品中殘留的AGs[21,24,25]，提取后溶液中含有大量水溶性雜質(zhì)，常用固相萃取方法對目標(biāo)物進行富集凈化處理。本研究采用空白基質(zhì)液過柱前加標(biāo)的方法對4種固相萃取柱(Oasis PRiME HLB、WCX、C18和MIP)的吸附效率和凈化效果進行評價。實驗結(jié)果表明，MIP柱對11種AGs回收率在75%～95%之間且凈化效果好; 而Oasis Prime HLB、WCX、C18柱對壯觀霉素的回收率均低于50%，對潮霉素、新霉素回收率低于60%。因此選擇MIP柱對提取液進行凈化。

圖2 不同pH值條件下AGs的上樣流出率Fig.2 Outflow rate of AGs at different pH value

3.2.2上樣溶液pH值的優(yōu)化AGs分子中含有多個羥基和氨基，在不同pH值條件下，AGs以不同的離子態(tài)形式存在于溶液中，進而影響目標(biāo)物在MIP柱上的保留性能。本研究考察了MIP柱對不同pH值的上樣溶液的吸附性能，其中上樣溶液為100 μg/L AGs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上樣溶液pH值分別調(diào)整為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，過柱后收集其流出液，將流出液與同等濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液對比，評價MIP柱對11種AGs的吸附效率(目標(biāo)物流出率=流出液中目標(biāo)物峰面積/同等濃度目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積×100%)。結(jié)果表明，除壯觀霉素、安普霉素、卡那霉素和潮霉素B受pH值影響較大外，其它組分所受影響很小，可以忽略不計。不同pH值下壯觀霉素、安普霉素、卡那霉素和潮霉素B流出率見圖2。由圖2可見，pH從6.5升至7.0時，AGs的流出率逐漸降低; pH從7.5升至8.5時，流出率顯著增加; 而在中性條件下，流出率最低。這可能是由于在酸性或堿性條件下，AGs分子更易得質(zhì)子或失質(zhì)子，不利于其與MIP吸附劑形成相互作用力，從而使AGs在MIP柱上的保留能力變?nèi)鮗26]。因此應(yīng)將上樣溶液的pH值嚴(yán)格控制在7.0～7.5，以避免上樣損失。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)的研究

由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的內(nèi)源性化合物，易與待測物一同進入色譜柱，干擾目標(biāo)化合物的檢測，因此需要對基質(zhì)效應(yīng)進行評價[27]?；|(zhì)效應(yīng)計算公式[28,29]為: 基質(zhì)效應(yīng)=(1-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%。結(jié)果表明，樣品基質(zhì)對壯觀霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素的抑制率>60%，對其余AGs的抑制率為5%～40%。由于基質(zhì)效應(yīng)明顯，本研究中采用空白基質(zhì)液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線所需溶液，或者采用標(biāo)準(zhǔn)添加法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線所需溶液，以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.4 方法分析性能以及評價

3.4.1線性范圍及檢出限以南美白對蝦為基質(zhì)，各AGs添加水平分別為0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、10.0和20.0 μg/kg，經(jīng)提取凈化后上機分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，各化合物定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以S/N≥3，回收率>50%，精密度<30%為評價依據(jù)，確定方法檢出限為1.0～10.0 μg/kg。以S/N≥10，回收率>70%，精密度<20%為評價依據(jù)，確定方法定量限為2.0～20.0 μg/kg。11種AGs的回歸方程、線性范圍、方法檢出限及定量限見表2。

表2 11種AGs回歸方程、線性范圍、方法檢出限及定量限

Table 2 Calibration equation, linear range, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of 11 kinds of AGs

化合物Compound回歸方程Calibrationequation線性范圍Linearrange(μg/kg)相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficients(R2)方法檢出限LOD(μg/kg)方法定量限LOQ(μg/kg)巴龍霉素Paromomyciny=1078．09+6648．47x1．0～1000．99591．02．0壯觀霉素Spectinomyciny=1671．53+907．582x2．5～2500．99462．55．0妥布霉素Tobramyciny=561．998+1964．34x2．5～2500．99652．55．0慶大霉素Gentamyciny=-793．045+3111．64x2．5～2500．99842．55．0卡那霉素Kanamyciny=1016．76+3803．45x1．0～1000．99851．02．0潮霉素BHygromycinBy=854．262+750．419x2．5～2500．99622．55．0安普霉素Apramyciny=3550．41+1257．34x2．5～2500．99872．55．0鏈霉素Streptomyciny=4163．46+2256．6x2．5～2500．99962．55．0雙氫鏈霉素Dihydrostreptomyciny=3691．3+9127．29x1．0～1000．99941．02．0丁胺卡那霉素Amikaciny=926．327+1198．91x2．5～2500．99852．55．0新霉素Neomyciny=490．458+489．118x10．0～10000．997110．020．0

3.4.2方法準(zhǔn)確度和精密度以陰性南美白對蝦、草魚和河蟹為檢測對象，通過標(biāo)準(zhǔn)添加實驗，考察方法的加標(biāo)回收率和精密度。添加水平: 巴龍霉素、卡那霉素、雙氫鏈霉素分別為2.0、4.0和50.0 μg/kg; 安普霉素、丁胺卡那、壯觀霉素、妥布霉素、潮霉素B、慶大霉素、鏈霉素分別為5.0、10.0和125.0 μg/kg; 新霉素分別為20.0、40.0和500.0 μg/kg，每個加標(biāo)濃度做6個平行實驗， 11種AGs的平均加標(biāo)回收率和精密度見表3。由表3可知，在不同的樣品中11種化合物加標(biāo)回收率在78.4%～109.6%之間，RSD(n=6)在2.3%～14.9%之間，方法準(zhǔn)確度和精密度滿足微量分析的要求。

3.5 實際樣品分析

隨機在上海農(nóng)貿(mào)市場選取草魚樣品7個、南美白對蝦樣品7個、河蟹樣品6個，采用本方法對樣品中11種AGs進行檢測，20個樣品中均未檢出AGs。

4 結(jié) 論

建立了水產(chǎn)品中11種氨基糖苷類藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。采用磷酸鹽緩沖溶液作為提取劑，MIP固相萃取柱富集凈化，Obelisc R柱進行分離，不使用離子對試劑的條件下實現(xiàn)了11種氨基糖苷化合物的同時檢測。本方法具有靈敏度高、通用性強等優(yōu)點。

表3 空白南美白對蝦、草魚和河蟹樣品中11種AGs的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of 11 AGs in shrimp, grass carp and carb blank samples (n=6)

化合物Compound加標(biāo)量Spiked(μg/kg)南美白對蝦Whiteshrimp回收率Recovery(%)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)草魚Grasscarp回收率Recovery(%)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)河蟹Carb回收率Recovery(%)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)巴龍霉素Paromomycin壯觀霉素Spectinomycin妥布霉素Tobramycin慶大霉素Gentamycin卡那霉素Kanamycin潮霉素BHygromycinB安普霉素Apramycin鏈霉素Streptomycin雙氫鏈霉素Dihydrostreptomycin丁胺卡那霉素Amikacin新霉素Neomycin2．088．210．691．412．7100．210．54．083．05．686．58．593．512．250．094．99．287．98．796．67．35．0102．88．692．313．893．511．610．093．87．689．66．699．36．8125．089．74．195．55．499．75．05．093．212．594．914．789．514．310．093．15．289．712．298．08．8125．089．59．384．49．799．27．85．078．412．783．910．686．514．110．090．014．587．212．787．014．9125．081．413．798．39．192．37．92．093．511．892．86．193．77．34．0100．811．0102．16．3101．86．650．095．012．297．33．1106．33．25．0109．611．695．514．795．79．510．093．912．0102．111．698．86．9125．090．011．098．48．094．54．75．0100．611．8105．68．993．96．710．0105．69．298．98．8100．67．5125．078．94．297．23．6100．57．15．095．910．288．414．694．710．510．092．85．5103．39．295．711．0125．093．32．7108．96．6102．57．22．090．06．294．07．798．99．24．094．411．890．810．095．98．750．096．82．390．94．2106．27．95．0108．711．396．08．8103．37．210．099．711．1102．16．3105．24．9125．092．67．489．14．697．23．120．0107．413．688．312．7100．113．840．0108．19．992．614．0104．910．9500．0102．76．789．313．496．68．1

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