中緬邊境流行區(qū)惡性瘧原蟲野生株馴化方式的研究

閆 妍 韋煥蘋 洪明陽 朱曉彤 曹雅明

(中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，遼寧沈陽 110122)

瘧疾是嚴(yán)重危害人類健康的重要全球性蟲媒傳染病。過去十年，雖然世界各地抗瘧的努力大大削弱了瘧疾的傳播，但瘧疾特別是在熱帶地區(qū)仍威脅著數(shù)百萬兒童的生命(WHO, 2017)。瘧疾實驗室研究在許多重要科研進展的推動下發(fā)展迅速，其中就包括瘧原蟲的紅內(nèi)期體外培養(yǎng)。至今只有惡性瘧原蟲Plasmodiumfalciparum和諾氏瘧原蟲P.knowlesi可體外連續(xù)長期培養(yǎng)，且前者是導(dǎo)致人類瘧疾發(fā)病率和死亡率最高的瘧原蟲(Grüringetal., 2014; Claessensetal., 2017)。1976年William Trager等建立了對惡性瘧原蟲體外無性階段超過50 d的連續(xù)培養(yǎng)，大大加速了惡性瘧原蟲的研究進展(Trageretal., 1976)。惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)的出現(xiàn)奠定了瘧疾科學(xué)研究的基礎(chǔ)，為瘧疾的研究及藥物的發(fā)展開啟了一扇大門。人血漿為惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)重要的營養(yǎng)成分，但是由于其不能商品化，在探索惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)的歷史中，研究人員試圖體外使用動物血漿來代替人血漿，但是并沒有獲得成功(Ifedibaetal., 1980; Divoetal., 1982; Divoetal., 2010)。

自然選擇過程使物種適應(yīng)環(huán)境，體外培養(yǎng)的惡性瘧原蟲同樣在體外生長過程中逐漸適應(yīng)實驗室環(huán)境而最終處于基因穩(wěn)定狀態(tài)(Stewart, 2012; Epstein, 2013)，參照《中華人民共和國種子法》的有關(guān)定義處于基因穩(wěn)定的蟲株具有寄生蟲學(xué)研究價值，可作為惡性瘧原蟲種質(zhì)資源。美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏中心(American Type Culture Collection-ATCC)收藏了多種活體瘧原蟲，其中包括多種惡性瘧原蟲株FCR-1、HB-2、HB-3等，它們被廣泛的用于瘧疾研究。但是中國惡性瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)株建立及蟲株資源卻相對匱乏，而生物活體資源的保存及開發(fā)已成為評價國家綜合國力的指標(biāo)之一，因此建立適應(yīng)我國實驗室條件的惡性瘧原蟲標(biāo)準(zhǔn)株具有重要意義。本研究旨在探討惡性瘧原蟲野生株體外培養(yǎng)的馴化方法，采用添加ALBUMAX II 及次黃嘌呤的改良培養(yǎng)基配方(Srivastava, 2007)，通過逐漸脫離人血漿的培養(yǎng)方式進行人工馴化臨床惡性瘧原蟲株。最終建立了可脫離人血漿連續(xù)培養(yǎng)的實驗室活體蟲株，為今后惡性瘧原蟲實驗室研究做積累。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI Medium 1640(gibco)、HEPES(GENVIEW)、NaHCO3(北京化工)、次黃嘌呤(MACKLIN)、ALBUMAX II(gibco)、慶大霉素(華潤雙鶴)、健康人A型紅細(xì)胞(沈陽市中心血站)、健康人A型血漿(沈陽市中心血站)、哌喹(DBI)、雙氫青蒿素(DBI)、甲氟喹(SIGMA)、氯喹(SIGMA)、萘酚喹(MCE)、D-山梨醇(SIGMA)、SYBR green(Thermo)、吉姆薩染液(Solarbio)、人造香柏油(上海標(biāo)本模型廠)、離心管(15 mL、50 mL，BEAVER)、25T培養(yǎng)瓶(LabServ)、無菌注射器(50 mL，上海凱樂)、孔徑0.22 μm濾器(MILLEX)、96孔培養(yǎng)板(Sunub)、96孔藥測板(上海晶安)、載玻片(SAIL BRAND)。

1.2 流行區(qū)惡性瘧原蟲野生株的采集

惡性瘧原蟲野生株F09A28、F09H34、N13-1231、N13-29、N13-764、N13-579、F07-50、F08B71、F08B38、F09N76、N13-1047、N13-1124，取于中緬邊境2007～2009年瘧疾感染區(qū)臨床病人血樣，樣本采集均獲中國及緬甸衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。采集病人新鮮抗凝血樣經(jīng)過涂片吉姆薩染色及快速診斷試驗(Rapid diagnostic test, RDTs)診斷為惡性瘧原蟲單一感染；經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌3遍去除血漿及白細(xì)胞，取100 μL樣本血添加150 μL新鮮洗滌紅細(xì)胞進行培養(yǎng)。

1.2.1惡性瘧原蟲培養(yǎng)條件: 紅細(xì)胞壓積2.5%；培養(yǎng)體系10 mL；培養(yǎng)液采用添加ALBUMAX II 及次黃嘌呤的改良培養(yǎng)基配方，1 L培養(yǎng)基成份及量為：RPMI 1640 10.4 g，NaHCO32.1 g，HEPES 5.94 g，ALBUMAX II 5 g，次黃嘌呤 0.05 g，慶大霉素 50 mg；培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，5% CO2，5% O2，90% N2氣體孵箱；無菌環(huán)境。培養(yǎng)液在復(fù)蘇初期對臨床蟲株進行馴化的過程中加入2%人血漿，蟲株生長平穩(wěn)后撤掉血漿，生長平穩(wěn)即形態(tài)：環(huán)狀體期環(huán)結(jié)構(gòu)完整清晰，滋養(yǎng)體及裂殖體期胞漿豐富飽滿且蟲體結(jié)構(gòu)完整；蟲株每個生長周期的增長率基本一致為生長穩(wěn)定狀態(tài)。培養(yǎng)方法：換液，根據(jù)感染率情況決定換液時間，原蟲感染率 <1%，間隔48 h換液；1% < 原蟲感染率 < 4%時，間隔24 h換液。在保持惡性瘧原蟲感染率于0.2%～1%之間的同時按時補充新鮮的紅細(xì)胞，如培養(yǎng)物寄生率過低或無法查看到原蟲則采用二倍稀釋的方式每周進行1次新鮮紅細(xì)胞的補充，且在每周中間即第3～4 d時吸走70 μL培養(yǎng)瓶中血同時添加70 μL的新鮮紅細(xì)胞于10 mL培養(yǎng)體系中，進而保證紅細(xì)胞的新鮮。

1.2.2惡性瘧原蟲5%山梨醇同步化: 當(dāng)惡性瘧原蟲的感染率 >1%，環(huán)狀體比率 >30%時，取蟲血，加入10倍體積的5%山梨醇，邊加邊混勻。37 ℃孵育10 min，去上清，加入10倍體積不完全培養(yǎng)基，快加，混勻重懸紅細(xì)胞后離心。由于滲透壓的作用，惡性瘧原蟲各個時間的蟲株只有環(huán)狀體期可存活，以此可同步蟲株處于環(huán)狀體時期。

1.2.3人血漿對實驗室馴化過稱蟲株生長影響探究: 在復(fù)蘇后第28 d選擇生長情況較穩(wěn)定的2株蟲株N13-1231、N13-764，分為4瓶培養(yǎng)：N13-1231加人血漿組、N13-1231無人血漿組、N13-764加人血漿組、N13-764無人血漿組。N13-1231及N13-764加人血漿組分別給予含2%人血漿的培養(yǎng)基培養(yǎng)；起始24 h感染率均調(diào)整為0.5%且同步化為環(huán)狀體時期，連續(xù)觀察120 h，每24 h進行感染率的計數(shù)。

1.2.4人血漿對實驗室馴化后蟲株生長影響探究: N13-1231和F08B38兩株蟲株1～38 d進行2%人血漿培養(yǎng)，第38 d撤掉人血漿后依舊生長穩(wěn)定。兩株蟲株體外培養(yǎng)第38 d分別設(shè)置加血漿組及不加血漿組進行生長情況觀察，兩株蟲株于第38 d凍存處理，留微量液體補液補血繼續(xù)培養(yǎng)，默認(rèn)初始感染率為0做分析，每個2 d(每蟲株生長周期)對4組蟲株感染率監(jiān)測，對第38～46 d數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.5蟲株藥物敏感性測定(SYBR green半數(shù)抑制濃度值IC50法): 惡性瘧原蟲同步化至環(huán)狀體比率 >70%。配制惡性原蟲細(xì)胞懸濁液，配制紅細(xì)胞壓積為2%原蟲感染率為0.5%細(xì)胞懸濁液。藥物稀釋液與配置好的瘧原蟲細(xì)胞液混勻于96孔板中在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；置藥板-80°冰箱30 min后室溫放置至孔中蟲血完全溶化，加入等體積的SYBR green 的裂解液，混勻后，避光放置0.5 h，轉(zhuǎn)移入96孔黑色酶標(biāo)板。采用Bio-Rad酶標(biāo)儀，采用485 nm激發(fā)波長和535 nm發(fā)射波長測量熒光信號值。對適應(yīng)體外連續(xù)培養(yǎng)的惡性瘧原蟲株N13-1231，F(xiàn)08B38進行抗瘧藥物哌喹(PQ)、雙氫青蒿素(DHA)、甲氟喹(MQ)、氯喹(CQ)、萘酚喹(NQ)體外藥物敏感性測定。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)分析: 應(yīng)用GraphPad Prism擬合出抗瘧藥物抑制曲線及計算抗瘧藥物IC50值；人血漿對惡性瘧原蟲培養(yǎng)影響顯著性分析：首先檢驗加人血漿和不加人血漿感染率差值隨時間的變化是否有顯著趨勢，如果有則表明加血漿與不加人血漿對惡性瘧原蟲的培養(yǎng)有顯著差別。如果沒有顯著趨勢，則需檢驗差值是否為0，如果接受為0則表示沒有顯著差異，否則有顯著差異。趨勢檢驗采用KPSS平穩(wěn)性檢驗，差值為0的檢驗采用t檢驗。對于人血漿和時間變化對惡性瘧原蟲生長進行多因素相關(guān)性分析，應(yīng)用matlab進行多元線性回歸模型擬合，擬合方程可見時間及人血漿對感染率的影響相關(guān)性正負(fù)及相對大??；復(fù)決定系數(shù)R2可見人血漿及時間對蟲株感染率相關(guān)性強弱，越接近1，則相關(guān)性越強。

2 結(jié)果

2.1 12株惡性瘧原蟲野生株體外培養(yǎng)生長情況

N13-29和F08B71株復(fù)蘇失敗。另外10株進行加2%人血漿培養(yǎng)基培養(yǎng)至第38 d，此時蟲株生長穩(wěn)定即每個周期增長倍數(shù)穩(wěn)定且蟲株環(huán)狀體期形態(tài)完整，滋養(yǎng)體裂殖體胞漿豐富完整瘧色素及核完整清晰，配子體罕見，顯微鏡下死蟲罕見。10株蟲株復(fù)蘇0～144 h生長曲線見圖1，橫坐標(biāo)為復(fù)數(shù)后的小時數(shù)，每隔24 h做一次換液及吉姆薩染色計數(shù)感染率，縱坐標(biāo)為蟲株的活蟲感染率。生長曲線可見復(fù)蘇初期蟲株的生長情況不一，曲線的斜率表示蟲株的生長快慢。圖中可見復(fù)蘇后0～144 h內(nèi)N13-764蟲株生長速率最快，且在第96 h開始生長加速生長；F09N76生長速率最慢，曲線極其平緩；且各個蟲株都表現(xiàn)為復(fù)蘇后的生長速率逐漸增加，是蟲株逐漸適應(yīng)體外實驗室培養(yǎng)的過程。

圖1 10株惡性瘧原蟲復(fù)蘇后0～144 h的生長曲線Fig.1 Growth curve of 10 P. falciparum isolates in 0-144 hours after recovery不同顏色曲線表示不同蟲株 Different color curves represent different strains.

2.2 人血漿對實驗室馴化過程中蟲株生長影響

探討人血漿對于體外培養(yǎng)臨床惡性瘧原蟲的馴化過程作用，在復(fù)蘇后第28 d對N13-1231加人血漿、N13-1231不加人血漿、N13-764加人血漿、N13-764不加人血漿4組蟲株，由于蟲株的連續(xù)生長至120 h感染率已經(jīng)大于5%，必須進行處理來調(diào)整感染率，這樣就進行了一個新的120 h起始生長周期，且一般認(rèn)為瘧原蟲經(jīng)3周左右的適應(yīng)性培養(yǎng)即可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，綜上選擇第5個120 h對4組蟲株連續(xù)觀察，每24進行感染率的計數(shù)后進行統(tǒng)計分析觀察120 h，結(jié)果見下圖2，橫坐標(biāo)表示時間，每24 h為1個觀測點，對蟲株進行換液及感染率分蟲株時期計數(shù)；縱坐標(biāo)為計數(shù)的2 000個紅細(xì)胞中活蟲數(shù)量；不同色塊代表實驗組是否加人血漿培養(yǎng)。將加血漿數(shù)據(jù)和未加血漿對應(yīng)時間的數(shù)據(jù)相減，得到時間序列，通過KPSS檢驗法檢驗時間序列的平穩(wěn)性，即加血漿和不加血漿感染率差值是否有明顯隨時間變化趨勢。原假設(shè)為平穩(wěn)，備選假設(shè)為不平穩(wěn)。通過計算得N13-1231拒絕原假設(shè)，具有顯著差異，P=0.033，N13-764拒絕原假設(shè)，具有顯著差異，P=0.047，即血漿在馴化過程中對蟲株的生長具有不可替代的作用。人血漿和時間變化對惡性瘧原蟲生長影響進行多因素相關(guān)性分析，通過多元線性回歸模型擬合，擬合平面見圖4，其中橫向(x)為是否加人血漿(加為1，不加為0)；縱向(y)為時間(h)；豎向(z)為感染率(%)。N13-1231擬合方程為z= -0.9353+0.4806x+0.04391y；N13-764擬合方程為z=-0.5544+0.737x+0.0134y。可見時間及人血漿與蟲株生長為正相關(guān)；N13-1231復(fù)決定系數(shù)R2=0.760，N13-764復(fù)決定系數(shù)R2=0.716，說明人血漿和時間變化對惡性瘧原蟲生長相關(guān)性較強。

圖2 人血漿對惡性瘧原蟲株培馴化過程生長影響Fig.2 Effect of human plasma on the domestication and growth of P.falciparum isolates in 120 hoursA. N13-1231蟲株生長折線圖; B. N13-764蟲株生長折線圖。B. A. Line chart of N13-1231 growth; B. Line chart of N13-764 growth.

圖4 人血漿和時間與惡性瘧原蟲株馴化過程生長多因素關(guān)聯(lián)性分析Fig.4 Multivariate correlation analysis between human plasma,time and parasitemia during acclimationA. N13-1231蟲株; B. N13-764蟲株。A．P. falciparum isolate N13-1231；B. P. falciparum isolate N13-764.

2.3 人血漿對實驗室馴化后蟲株生長影響

N13-1231和F08B38兩株蟲株體外連續(xù)加滅活去纖維蛋白原人血漿培養(yǎng)第38～46 d分別設(shè)置加血漿組及不加血漿組，生長曲線見圖3，橫坐標(biāo)為復(fù)蘇起后蟲株連續(xù)培養(yǎng)的天數(shù)；縱坐標(biāo)為原蟲感染率，兩株蟲株于第38 d凍存處理，默認(rèn)初始感染率為0做分析；曲線黑色為N13-1231加人血漿培養(yǎng)組，灰色為N13-1231無人血漿培養(yǎng)組；紅色為F08B38加人血漿培養(yǎng)組，粉色為F08B38無人血漿培養(yǎng)組。繼續(xù)無血漿培養(yǎng)至第90 d，兩株蟲株生長一直保持平穩(wěn)。將加血漿數(shù)據(jù)和未加血漿對應(yīng)時間的數(shù)據(jù)相減，得到時間序列，通過KPSS檢驗法檢驗時間序列的平穩(wěn)性，即加血漿和不加血漿感染率差值是否有明顯隨時間變化趨勢。原假設(shè)為平穩(wěn)，備選假設(shè)為不平穩(wěn)。N13-1231 KPSS檢驗沒有顯著趨勢，P=0.0837，t檢驗沒有顯著差異，P=0.3347。F08B38 KPSS檢驗沒有顯著趨勢，P=0.1，t檢驗沒有顯著差異，P=0.5767。結(jié)果可見血漿對于馴化成功蟲株生長影響無統(tǒng)計學(xué)差異。

圖3 N13-1231和F08B38生長曲線(38～46 d)Fig.3 The growth curves of N13-1231 and F08B38 between 38-46 days

2.4 薄血片吉姆薩染色惡性瘧原蟲形態(tài)

惡性瘧原蟲株N13-1231，F(xiàn)08B38體外90 d連續(xù)培養(yǎng)，各個時期蟲株形態(tài)，見圖5-A，從左至右分別復(fù)蘇后第10個生長周期顯微鏡油鏡下為環(huán)狀體、滋養(yǎng)體、裂殖體期蟲株形態(tài)，可見環(huán)狀體期環(huán)結(jié)構(gòu)完整清晰，滋養(yǎng)體及裂殖體期胞漿豐富飽滿且蟲體結(jié)構(gòu)完整，為生長穩(wěn)定活躍狀態(tài)，兩蟲株已適應(yīng)體外無血漿培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)。惡性瘧原蟲株馴化過程中撤掉血漿后會出現(xiàn)配子體增多現(xiàn)象，見圖5-B，從左至右分別為第28 d馴化過程中撤掉血漿組蟲株血片出現(xiàn)的未成熟配子體、雌配子體、雄配子體期蟲株油鏡下形態(tài)。

圖5 野生株惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)形態(tài)觀察Fig.5 Morphological observation of P. falciparum wiled isolates cultured in vitroA. N13-1231、F08B38蟲株3個時期顯微鏡下(10×100)形態(tài); B. 退化蟲株三種配子體顯微鏡下(10×100)形態(tài)。A. The morphology of three stages from N13-1231 and F08B38 isolates under microscope (10×100); B. The morphology of three gametocyte from degenerate strains under microscope (10×100).

2.5 體外抗瘧藥物抑制曲線及IC50值

N13-1231、FO8B38蟲株體外5種抗瘧藥物抑制曲線，為藥物濃度log10值與抑制率關(guān)系曲線，不同藥物的測定都設(shè)立一個3D7標(biāo)準(zhǔn)株對照，可知3D7為藥物敏感株。見圖6，橫坐標(biāo)為藥板終濃度的log10值，縱坐標(biāo)為對應(yīng)濃度藥物對蟲株生長抑制率，不同顏色代表不同抗瘧藥物；參考文獻(xiàn)中抗瘧藥物抗性閾值PQ 12.80、DHA 7.70、MQ 20.00、CQ 25.00、NQ 5.24 nmol/L(Price, 1999; Suwandittakul, 2009; Cui, 2012; 郝明明, 2013; 袁麗莉, 2013)，可見N13-1231蟲株具有PQ、DHA及MQ抗性，而CQ、NQ敏感性；F08B38蟲株具有PQ、DHA、CQ抗性，而MQ、NQ敏感性。

圖6 體外5種抗瘧藥物抑制曲線Fig.6 The inhibition curves of five antimalarial drugs in vitro cultureA. N13-1231蟲株; B. F08B38蟲株。A. N13-1231 P. falciparum isolates; B. F08B38 P. falciparum isolates.

3 討論

體外復(fù)蘇0～6 d(0～144 h)惡性瘧原蟲株生長擬合曲線各個點曲線斜率不同，反映了不同蟲株的生長速率不一致性。盡管復(fù)蘇的蟲株凍存體系一致(紅細(xì)胞250 μL，瘧原蟲環(huán)狀體感染率2%)，但仍然會有凍存時活蟲多少的量誤差。凍存時環(huán)狀體期的早晚也是影響復(fù)蘇后生長速率的因素，除人為操作影響因素外蟲株自身紅細(xì)胞侵襲能力有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)裂殖子表面蛋白1(Msp 1)與惡性瘧原蟲的紅細(xì)胞侵襲能力有關(guān)，裂殖子表面主要的GPI相關(guān)蛋白，可能參與逃避宿主免疫應(yīng)答為機制(Holder, 1994)。惡性瘧原蟲體外培養(yǎng)的歷史中，研究人員試圖在體外培養(yǎng)初期使用動物血漿來代替人血漿，但是并沒有獲得成功(Ifediba, 1980; Divo, 1982; Divo, 2010)。本實驗中在兩株惡性瘧原蟲株體外培養(yǎng)初期加人血漿和不加人血漿對照組KPSS時間序列平穩(wěn)性檢驗差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，人血漿和時間變化對惡性瘧原蟲生長影響進行多因素相關(guān)性分析，可見時間及人血漿與蟲株生長為正相關(guān)，且人血漿和時間變化對惡性瘧原蟲生長相關(guān)性較強。進一步證實惡性瘧原蟲體外馴化過程中，人血漿為必不可少的營養(yǎng)成分。復(fù)蘇生長至38 d撤掉人血漿培養(yǎng)，此時所有蟲株體外馴化生長平穩(wěn)，蟲株為N13-1231和F08-38可在無人血漿的培養(yǎng)條件下平穩(wěn)連續(xù)生長至90 d，其余蟲株逐漸退化。人血漿不能商品化生產(chǎn)，實驗室使用存在供應(yīng)途徑及量的問題，且人血漿成分不利于科研實驗設(shè)計，因此本實驗采自中緬邊境惡性瘧流行區(qū)兩蟲株可在無血漿長期連續(xù)培養(yǎng)具有科學(xué)研究價值。N13-1231和F08B38體外馴化成功不需要人血清/血漿生長刺激，基因型穩(wěn)定(Duffyetal., 2018)，在后續(xù)研究中需進行測序以明確蟲株的基因型。對馴化成功兩蟲株進行抗瘧藥物敏感性測定，所測結(jié)果N13-1231蟲株具有PQ、DHA及MQ抗性，F(xiàn)08B38具有PQ、DHA、CQ抗性，取樣于中緬邊境地區(qū)，此地區(qū)有報道出現(xiàn)DHA-PQ聯(lián)合用藥抗藥性及MQ、CQ抗藥性(郝明明, 2013; WHO, 2017)，兩蟲株對抗藥性機制研究及地域性基因突變進化具有價值，對于抗性是否穩(wěn)定仍需以后長期觀察。

惡性瘧原蟲臨床株實驗室培養(yǎng)馴化過程中人血漿成分不可取代。N13-1231和F08-138兩蟲株，通過實驗室初期加人血漿培養(yǎng)逐漸過渡適應(yīng)無血漿且長期連續(xù)培養(yǎng)，具有惡性瘧科學(xué)研究價值。兩實驗室新株具有特定的實驗室抗性，其中N13-1231蟲株具有PQ、DHA及MQ抗性而CQ、NQ敏感性；F08B38具有PQ、DHA、CQ抗性MQ、NQ敏感性。本研究可為今后瘧原蟲實驗室研究提供活體蟲株資源及實驗室依據(jù)。