合歡皮總皂苷治療旋毛蟲感染小鼠的療效觀察

，，，，，，

旋毛蟲病(trichinellosis)是由毛形線蟲屬旋毛蟲引發(fā)的一種嚴(yán)重的人獸共患疾病，因生食或半生食含有旋毛蟲囊包幼蟲的肉類所致，旋毛蟲在胃中消化釋放出來(lái)，在腸道中激活[1-2]。近年來(lái)，我國(guó)旋毛蟲病暴發(fā)次數(shù)增加，20世紀(jì)初中國(guó)發(fā)生了17次旋毛蟲病的暴發(fā)，有828人患病，其中11人死亡[3]。

自2015年屠呦呦獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)以來(lái)，人們對(duì)傳統(tǒng)中藥的關(guān)注度越來(lái)越高。合歡皮為《中國(guó)藥典》收錄的豆科植物合歡的莖皮，具有解郁安神、活血消腫功效[4]。合歡皮的成分主要包括三萜類化合物、黃酮類化合物、木質(zhì)素類化合物、生物堿、多糖等。俞琦等[5]通過(guò)研究證實(shí)了合歡皮的抗炎作用，但是關(guān)于是否是合歡皮中總皂苷成分發(fā)揮作用以及是否對(duì)旋毛蟲幼蟲感染引起的炎癥起作用卻不得而知。本研究通過(guò)計(jì)數(shù)旋毛蟲成蟲和肌幼蟲，HE染色計(jì)數(shù)囊包幼蟲和免疫組化檢測(cè)IL-1β，IL-6，TNF-α，COX-2的表達(dá)，對(duì)合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑治療旋毛蟲感染小鼠的療效進(jìn)行觀察和比較。

1 材料與方法

1.1旋毛蟲來(lái)源 旋毛蟲(ISS-534)蟲株為豬源旋毛蟲，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室提供，經(jīng)江蘇省寄生蟲病防治研究所保種傳代。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡的ICR雄性小鼠，體重25～30 g，清潔級(jí)，30只小鼠均由江蘇省寄生蟲病防治研究所提供，每只小鼠感染300條旋毛蟲，實(shí)驗(yàn)期間自由飲水飲食。

1.3藥品 阿苯達(dá)唑購(gòu)自Sigma公司，藥物由7%吐溫80和3%乙醇溶液配制成懸液[6]，阿苯達(dá)唑的給藥量為50 mg/(kg·d)[7]。

1.4合歡皮總皂苷干粉的制備 合歡皮購(gòu)自無(wú)錫山禾藥業(yè)集團(tuán)，產(chǎn)地浙江。將合歡皮用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩，75%乙醇加熱回流2次，每次2 h，合并提取液，過(guò)濾，取濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，去離子水復(fù)溶，接著用水飽和正丁醇萃取4次，收集正丁醇相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，再次復(fù)溶，置于真空干燥箱中烘干，制得干粉并稱重。合歡皮總皂苷粉末的給藥量為8 mg/(kg·d)。

1.5動(dòng)物分組與療效觀察 將36只感染旋毛蟲的ICR小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只。組Ⅰ-Ⅲ為成蟲組：組Ⅰ為感染對(duì)照組，組Ⅱ?yàn)楹蠚g皮總皂苷治療組，組Ⅲ為阿苯達(dá)唑治療組；組Ⅳ-Ⅵ為肌幼蟲組：組Ⅳ為感染對(duì)照組，組Ⅴ為合歡皮總皂苷治療組，組Ⅵ為阿苯達(dá)唑治療組。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組于感染后第2 d開始給藥，連續(xù)給藥3 d，于感染后第7 d處死，剖取小腸，并切成1 cm小段，取一段放入生理鹽水中于37 ℃中孵育3 h，計(jì)數(shù)小腸內(nèi)成蟲[8]；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組于感染后第7 d開始給藥，連續(xù)給藥14 d，于感染后第40 d處死，取出膈肌，其余肌肉組織絞碎，于配好的37 ℃消化液中消化2 h，全部消化后棄去上清，生理鹽水清洗3次，鏡下計(jì)數(shù)肌幼蟲[9]。計(jì)數(shù)平均蟲數(shù)和減蟲率，減蟲率=[(感染對(duì)照組-治療組)/感染對(duì)照組]×100%收集Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組小鼠膈肌，固定于10%福爾馬林溶液中，24 h后脫水切片(厚5 μm)，備用。

1.6HE染色計(jì)數(shù)膈肌中肌幼蟲 將上述石蠟切片65 ℃烘烤1 h，二甲苯脫蠟后水化，蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗10 min，1%鹽酸酒精分化10 s，伊紅染色 3 min，二甲苯透明，中性樹脂封片[10]。HE染色膈肌中肌幼蟲計(jì)數(shù)方法：每只小鼠取1張組織切片，使用正置顯微鏡進(jìn)行圖像采集，每張切片隨機(jī)拍攝5張視野(100×)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中肌幼蟲數(shù)。

1.7免疫組化檢測(cè)膈肌中炎癥因子表達(dá) 將上述石蠟切片烘烤、脫蠟、水化，抗原修復(fù)(90-100 ℃檸檬酸溶液水浴20 min)，PBS浸洗5 min×3次，1% Triton X-100室溫反應(yīng)10 min，3%過(guò)氧化氫室溫反應(yīng)15 min，BSA溶液37 ℃封閉30 min，甩去封閉液，滴加一抗(山羊IgG)，4 ℃過(guò)夜，室溫平衡30 min，PBS浸洗5 min×3次，DAB染色1～2 min，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染1 min，流水反藍(lán)5 min，鹽酸酒精分化5 s，流水反藍(lán)7 min，中性樹膠封片后鏡檢[11]。免疫組化陽(yáng)性結(jié)果判定：IL-1β胞漿呈棕黃色色斑或顆粒[11]，IL-6胞漿呈棕黃色染色[12]，TNF-α胞漿呈棕黃(褐)色染色[13]，COX-2胞漿呈棕色或深棕色[14]。免疫組化分析膈肌中炎癥因子平均光密度的方法：每只小鼠取1張組織切片，使用正置顯微鏡進(jìn)行圖像采集，每張切片隨機(jī)拍攝5張視野(400×)，用IMAGE-PRO PLUS 6.0軟件分析各免疫因子平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1合歡皮總皂苷對(duì)旋毛蟲成蟲和幼蟲的影響 給藥期間，各組小鼠均正常生長(zhǎng)，飲水飲食正常。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組中可以明顯看出，合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑治療組的成蟲數(shù)較未給藥組均明顯減少，減蟲率分別為70.34%和80.02%；從Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組可以看出給予合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑之后，囊包幼蟲較未給藥組也明顯減少，減蟲率分別為65.60%和90.66% 。各治療組的減蟲率與感染對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩組治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 計(jì)數(shù)感染對(duì)照組和給藥組旋毛蟲成蟲和幼蟲數(shù)
Tab.1 Trichinella spiralis adult and total larval counts in the control and drug-treated groups

組別Studiedgroups旋毛蟲成蟲計(jì)數(shù)T．spiralisadultcount旋毛蟲幼蟲計(jì)數(shù)T．spiralislarvaecountx±sPEfficacy(%reduction)x±sPEfficacy(%reduction)感染對(duì)照組Infectedandnon?treated193±1146，177±3675合歡皮總皂苷組Albiziajulibrissintotalsaponins55±80．000??a71．6015，838±9950．000??a65．70阿苯達(dá)唑組Albendazole36±90．000??81．244，644±10400．000??89．94

注：與感染對(duì)照組相比，**P<0.01；與阿苯達(dá)唑組相比，aP<0.05

Note: compared with infected control, **P<0.01; compared with albendazole-treated group,aP<0.05

2.2小鼠膈肌HE染色分析 HE染色可見(圖1)，感染對(duì)照組膈肌中有大量的囊包幼蟲且幼蟲周圍有大量炎癥細(xì)胞，肌纖維出現(xiàn)退化；而給予合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑治療后，肌纖維退化出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，且囊包幼蟲數(shù)和炎癥細(xì)胞都有明顯減少。分析膈肌中幼蟲得出合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑治療組的減蟲率分別為71.19%和89.83%，各治療組減蟲率與感染對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，兩組治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2 小鼠感染旋毛蟲后膈肌蟲荷的變化
Tab.2 Changes of larval burden in the diaphragm of mice after T.spiralis Infection

組別Studiedgroups囊包幼蟲計(jì)數(shù)Encystedlarvaecountx±sPEfficacy(%reduction)感染對(duì)照組Infectedandnontreated9±2合歡皮總皂苷組Albiziajulibrissintotalsaponins3±10．000??a71．19阿苯達(dá)唑組Albendazole1±10．000??89．83

注：與感染對(duì)照組相比，**P<0.01；與阿苯達(dá)唑組相比，aP<0.05

Note: compared with infected control, **P<0.01; compared with albendazole-treated group,aP<0.05

圖1 小鼠感染旋毛蟲后膈肌蟲荷的變化Fig.1 Changes of larval burden in the diaphragm of mice after T.spiralis Infection

2.3 免疫組化分析

2.3.1小鼠膈肌IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá) 各組小鼠炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)如下圖(圖2)。感染對(duì)照組小鼠各炎癥因子的表達(dá)明顯高于各給藥組，兩組治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

圖2 小鼠感染旋毛蟲后炎癥因子的變化Fig.2 Changes of inflammatory factors in mice after T.spiralis Infection

分組StudiedgroupsIL?1βIL?6TNF?αCOX?2感染對(duì)照組Infectedandnontreated71．60±24．82118．13±12．52166．87±64．37117．13±7．58合歡皮總皂苷組Albiziajulibrissintotalsaponins20．10±10．63?29．72±10．60??19．14±11．45?45．72±12．40??阿苯達(dá)唑組Albendazole17．94±1．62?17．08±5．76??10．07±2．23?36．80±17．12??

注：與感染對(duì)照組相比，*P<0.05；與感染對(duì)照組相比，**P<0.01

Note: compared with infected control, *P<0.05; compared with infected control, **P<0.01

2.3.2小鼠膈肌COX-2的表達(dá) 各組小鼠COX-2的表達(dá)如圖所示(圖3)。給予合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑之后都會(huì)降低COX-2的表達(dá)，兩組治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

圖3 小鼠感染旋毛蟲后COX-2的變化Fig.3 Changes of COX-2 in mice after T.spiralis Infection

2.3.3小鼠膈肌IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2表達(dá)平均光密度的改變 詳細(xì)結(jié)果見表3。

3 討 論

中藥是中華民族的瑰寶，是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥文化的寶貴財(cái)富。合歡皮總皂苷作為傳統(tǒng)中藥合歡皮的主要成分之一，具有安全、低毒等優(yōu)點(diǎn)，迄今為止未見有關(guān)該藥對(duì)旋毛蟲的作用的報(bào)道。本研究以小鼠為研究動(dòng)物模型，觀察感染后7 d(腸道期)和40 d(肌肉期)時(shí)藥物對(duì)旋毛蟲的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑?qū)δc道內(nèi)成蟲和肌肉內(nèi)幼蟲均有較好的療效，合歡皮總皂苷對(duì)成蟲和幼蟲的減蟲率分別為71.60%和65.70%。阿苯達(dá)唑?qū)Τ上x和幼蟲的減蟲率分別為81.24%和89.94%。雖然合歡皮總皂苷組的效果略次于阿苯達(dá)唑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是其使用劑量明顯低于阿苯達(dá)唑。眾多文獻(xiàn)中均已指出阿苯達(dá)唑?qū)πx感染各期均有較好的治療作用[15-16]。

宿主感染旋毛蟲后會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量的單核因子，例如IL-1β、IL-6、TNF-α等。IL-1β是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞損傷或應(yīng)對(duì)一些危險(xiǎn)信號(hào)時(shí)起關(guān)鍵作用[17]。TNF-α是一種強(qiáng)效促炎因子，它以多效性方式對(duì)多種細(xì)胞起生物學(xué)作用，并且在慢性炎癥的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。很多證據(jù)表明，旋毛蟲感染后宿主肌肉內(nèi)各種炎癥介質(zhì)會(huì)過(guò)度表達(dá)，繼而引起肌炎等炎癥相關(guān)的疾病的發(fā)生。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)旋毛蟲感染小鼠合歡皮總皂苷和阿苯達(dá)唑治療后小鼠肌肉中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，結(jié)果顯示兩組給藥組肌肉中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)明顯低于感染對(duì)照組，并且兩組治療組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

COX-2作為調(diào)節(jié)前列腺素和凝血惡烷產(chǎn)生的酶，其產(chǎn)量增多可引起疼痛和炎癥反應(yīng)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)兩組給藥組同樣可以減少COX-2的表達(dá)，且效果十分顯著。綜上所述，中藥合歡皮總皂苷具有抗小鼠旋毛蟲感染的作用，并且合歡皮總皂苷可調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，減輕炎癥相關(guān)疾病的發(fā)生，其效果可與阿苯達(dá)唑比擬，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

[1] Wen H, Hu CX, Wang LA, et al. Early serodiagnosis of trichinellosis by Western blot with excretory-secretory antigens fromTrichinellaspiralismuscle larvae[J]. Chin J Zoonoses，2016, 32(12):1058-1063. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.012.004 (in Chinese)

文慧,胡晨曦,王李昂,等.旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌抗原診斷早期旋毛蟲病的研究[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2016, 32(12):1058-1063.

[2] Ashour D S, Abou Rayia D M, Saad A E, et al. Nitazoxanide anthelmintic activity against the enteral and parenteral phases of trichinellosis in experimentally infected rats[J].Exper Parasitol, 2016, 170:28-35. DOI: 10.1016/j.exppara.2016.08.009.

[3] Wang S W, Wang Z Q, Cui J. Protein change of intestinal epithelial cells inducedinvitrobyTrichinellaspiralisinfectivelarvae[J]. Parasitol Res, 2011, 108(3):593-599. DOI: 10.1007/s00436-010-2102-9.

[4] Chinese Pharmacopoeia. Pharmacopoeia of People’s Republic of China [M]. Beijing:China Medical Science Presss. 2010: 134.

國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M]. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:134.

[5] Yu Q, Tian WY. A Preliminary Study on Anti-inflammatory and Antimicrobial Effects[J]. Acta Academiae Medicinae Zun Yi, 2005, 28(2):133-134. (in Chinese)

俞琦,田維毅.合歡皮飲抗炎及抗菌作用的初步研究[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 28(2):133-134.

[6] Xue J, Xiao SH, Xu LL, et al. Efficacy of Tribendimidine and Albendazole in Treating Mice Infected withTrichinellaspiralis[J].Chin J Parasitol Parasit Dis, 2010, 28(1):8-11. (in Chinese)

薛劍,肖樹華,徐莉莉,等. 三苯雙脒和阿苯達(dá)唑治療感染旋毛蟲小鼠的療效觀察[J]. 中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2010, 28(1):8-11.

[7] Attia R A, Mahmoud A E, Farrag H M, et al. Effect of myrrh and thyme onTrichinellaspiralisenteraland parenteral phases with inducible nitric oxide expression in mice[J]. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz, 2015, 110(ahead):1035-1041. DOI: 10.1590/0074-02760150295.

[8] Soliman G A, Taher E S, Mahmoud M A. Therapeutic efficacy of Dormectin, Ivermectin and Levamisole against different stages ofTrichinellaspiralisin rats[J]. Turkiye Parazitol Derg,2011, 35(2):86-91. DOI: 10.5152/tpd.2011.22.

[9] Li F, Wang ZQ, Cui J, et al. The optimized protocol of artificial digestion method for inspection ofTrichimellaspiralisin meat[J]. Chin J Prev Vet Med,2009, 31(7):540-544. (in Chinese)

李峰,王中全,崔晶,等.人工消化法檢驗(yàn)肉類中旋毛蟲優(yōu)化方案的研究[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009, 31(7):540-544.

[10] Yang X. Study on factors affecting HE staining of paraffin sections in rabbits ovarian[J]. Anhui Agri Sci Bull, 2009, 15(1):40-41. (in Chinese)

楊軒. 家兔卵巢石蠟切片HE染色影響因素的研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2009, 15(1):40-41.

[11] Gao X, Li YZ. ZD Preparation Inhibits the Inflammation Caused by Closed Soft Tissue Injuries in Mice by Reducing the Expression of IL-1β[J]. Anim Husb Feed Sci, 2016, 37(4):1-4. (in Chinese)

高鑫,李云章. ZD制劑對(duì)非開放性軟組織損傷模型小鼠肌肉中IL-1β表達(dá)的影響[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2016, 37(4):1-4.

[12] Xie Z, Wang XH, Xu JZ, et al. Impact of pulsed electromagnetic fields on expression of IL-6 in bone ovariectomy osteoporosis rats[J]. Chongqing Med, 2007, 36(9):790-792. (in Chinese)

謝肇,吳雪暉,許建中,等. PEMF對(duì)OVX-OP大鼠骨組織IL-6表達(dá)的影響及意義[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2007, 36(9):790-792.

[13] Zhang XL, Qin YW, Zhao XY. The effect of placenta derived tumor necrosis factor-α and myostatin in patients with preeclampsia and fetal development [J]. Chin J Postgrad Med, 2014, 37(12):46-50. (in Chinese)

張曉麗, 覃亦偉, 趙曉勇. 胎盤源性腫瘤壞死因子-α和肌肉生長(zhǎng)抑制素對(duì)子癇前期患者及胎兒發(fā)育的影響[J]. 中國(guó)醫(yī)師進(jìn)修雜志, 2014, 37(12):46-50.

[14] Li Y, Li P, Zhou Z, et al. Effects of fire needle on COX-2, IL-1β and BDNF expression in sciatic nerve injury model rats[J]. J Clin acupunct moxib, 2007, 23(12):36-39. (in Chinese)

李巖,李平,周震,等. 火針對(duì)坐骨神經(jīng)損傷模型大鼠COX-2、IL-1β、BDNF表達(dá)的干預(yù)研究[J].針灸臨床雜志, 2007, 23(12):36-39.

[15] Zhang HM, Shi Wei, Jiang H, et al. Study on the effect of tribendimidine in treatment of different infection stages ofTrichinellaspiralisin rat[J]. J Appl Prev Med, 2009, 15(1):9-11. (in Chinese)

張鴻滿,施維,江河,等. 國(guó)產(chǎn)驅(qū)蟲新藥三苯雙脒治療大鼠旋毛蟲感染的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2009, 15(1):9-11.

[16] Song MX, Lu YX, Zhang ZQ, et al. Efficacy of ivermectin and albendazole against the various phases of 4Trichinellaisolates in treating mice[J].Chin J Zoonoses, 2002, 18(4):89-91.(in Chinese)

宋銘忻,路義鑫,張子群,等.伊維菌素和丙硫咪唑?qū)π∈笮x病的療效試驗(yàn)[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2002, 18(4):89-91.

[17] Mariathasan S, Weiss D S, Newton K, et al. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP[J]. Nature, 2006, 440(7081):228-232.

[18] Horiuchi T, Mitoma H, Harashima S, et al. Transmembrane TNF-α: structure, function and interaction with anti-TNF agents[J]. Rheumatology, 2010, 49(7):1215-28. DOI: 10.1093/rheumatology/keq031.

[19] Funk C D, Fitzgerald G A. COX-2 inhibitors and cardiovascular risk[J]. J Cardiovascular Pharmacol, 2005, 20(3):123-125.