不同產(chǎn)地庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原菌的分離鑒定

吳玉鵬，趙曉梅

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆昌吉 831100；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物質(zhì)能源研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】庫(kù)爾勒香梨是最具新疆特色的地方果品之一[1]，巴音郭楞蒙古自治州(以下簡(jiǎn)稱“巴州”)和阿克蘇地區(qū)是庫(kù)爾勒香梨的主要產(chǎn)地。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2016年巴州地區(qū)庫(kù)爾勒香梨種植面積4.017×104hm2(60.26萬(wàn)畝)，產(chǎn)量42.83×104t，而同年阿克蘇地區(qū)庫(kù)爾勒香梨種植面積1.16×104hm2(17.45萬(wàn)畝)，產(chǎn)量35.03×104t。兩產(chǎn)地庫(kù)爾勒香梨種植面積和產(chǎn)量出入很大，主要因?yàn)榻鼛啄臧椭莸貐^(qū)凍害發(fā)生程度較重，對(duì)樹(shù)體造成了嚴(yán)重的影響，果品產(chǎn)量大幅度下降。庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病是近幾年發(fā)現(xiàn)的一種貯期病害，2013年庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病呈蔓延加重趨勢(shì)，輪臺(tái)園藝場(chǎng)大多梨園普遍發(fā)生，輕重不一，重者發(fā)病果率達(dá)30%[2]，損失嚴(yán)重，研究庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病的控制技術(shù)勢(shì)在必行?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】早期對(duì)蘋果梨的侵染過(guò)程及其預(yù)先合成抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)研究認(rèn)為6% CaCl2、l% 殼聚糖、45℃ 20 min和50℃ 10 min熱水處理均能有效地控制蘋果梨的黑斑病[3]。近10年來(lái)，由于萼端黑斑病對(duì)庫(kù)爾勒香梨的影響較大，有研究認(rèn)為庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病是一種由于果實(shí)品質(zhì)下降和N/Ca、K/Ca失調(diào)及缺鈣引起的生理性病害[4]，也有庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原菌是鏈格孢屬交鏈孢菌(Alternariaalternate(Fr.)Keissl)的報(bào)道[5-6]。【本研究切入點(diǎn)】采前噴鈣[7]、采后浸鈣[8]、采后1-MCP處理[9]以及采前噴鈣、采后1-MCP和MAP相結(jié)合[10]的處理等能較為有效地控制庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病的發(fā)生，并能保持果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)成分，增加其商品性，但目前對(duì)庫(kù)爾勒香梨兩大主產(chǎn)區(qū)巴州和阿克蘇地區(qū)萼端黑斑病病原菌生物學(xué)特性方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。以兩價(jià)目產(chǎn)地庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病果為研究對(duì)象，研究?jī)蓚€(gè)產(chǎn)地萼端黑斑病的疾病種類?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】調(diào)查統(tǒng)計(jì)兩大主產(chǎn)區(qū)庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病的發(fā)病情況，確定不同產(chǎn)區(qū)庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病致病菌種類，對(duì)優(yōu)勢(shì)或主導(dǎo)病原菌菌群進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，研究其病原菌的生物學(xué)特性，為庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病的防治提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 原料

從巴州和阿克蘇兩個(gè)主產(chǎn)區(qū)的果品冷庫(kù)采集到的庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病果。

1.1.2 試劑

PDA培養(yǎng)基、95%乙醇、75%乙醇、無(wú)水乙醇、10 mg/mL Rnase(Sigma)、異丙醇、10% SDS、1X TE(pH 8.0)、經(jīng) Millipore 過(guò)濾滅菌純化水。

1.1.3 設(shè)備

FA2004 型分析天平：上海蒲春計(jì)量?jī)x器有限公司；DL-1型萬(wàn)用電爐：北京永光明醫(yī)療儀器廠；C-C phase turret condenser型尼康顯微鏡：日本；SW-CJ-DF型潔凈工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；BPH-9042型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；LDZX-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；Eppendorf 5417R型離心機(jī)：德國(guó)；Millipore型純水儀：美國(guó)；DYY-7B型電泳儀：北京六一儀器廠。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離、純化

取兩地萼端黑斑病病果各2個(gè)，先后用清水、70%的酒精、無(wú)菌水沖洗果實(shí)表面，鑷取病健交界處果肉5 mm，在25℃ PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。從PDA培養(yǎng)基菌落邊緣挑取適量菌絲轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上，相同條件下純化培養(yǎng)。在培養(yǎng)的過(guò)程中觀察是否有其他雜菌生長(zhǎng)，反復(fù)培養(yǎng)多次直到分離出形態(tài)一致的菌株。將純化的菌株反接于健康果以確定致病性。

1.2.2 病原菌的確定

參照許玲等略改[11-13]，用75%酒精、無(wú)菌水沖洗果實(shí)，用無(wú)菌接種針刺3個(gè)大小深度一致的孔，再用含0.01% Tween-80的0.85%無(wú)菌生理鹽水配制孢子懸浮液，調(diào)節(jié)至1×106個(gè)孢子/mL。用移液槍移取30 μL孢子懸浮液注入傷口，每一菌株處理10個(gè)果實(shí)，以0.85%無(wú)菌生理鹽水作對(duì)照。以25℃ 90%～95%RH培養(yǎng)3～5 d。若發(fā)病癥狀與最初果實(shí)癥狀一致，則確定該菌株為萼端黑斑病致病菌。

1.2.3 病原菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

劃線培養(yǎng)：用無(wú)菌接種針沾取少量致病孢子，在PDA培養(yǎng)基上采用平板劃線法培養(yǎng)菌絲。倒置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察記錄。

載玻片培養(yǎng)法參照方中達(dá)[14]。

1.2.3.2 病原菌的分子鑒定

① 基因組 DNA 提取 ：在無(wú)菌狀態(tài)下取一定量菌株，加入液氮研磨；研磨好后放入1.5 mL離心管中，做好標(biāo)記，加入0.6 mL TE(pH 8.0)，混合均勻，使菌液充分懸?。患尤?50 μL 10% SDS，輕輕倒轉(zhuǎn)混勻；加入 3 μL蛋白酶 K(20 ng/μL)，輕輕混勻， 37℃水浴 1 h；加入 150 μL 5 mol/L NaCl，輕輕混勻；加入 150 μL 2% CTAB，輕輕混勻，65℃水浴 20 min； 12 000 r/m 常溫離心 20 min；吸取上清液至1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，在室溫下放置 30 min，4℃ 條件轉(zhuǎn)速12 000 r/m離心 10 min；去除上清液，加 入750 μL 70%乙醇，充分混勻，在4℃ 下轉(zhuǎn)速12 000 r/m離心 2 min；加入 30 μL 10 ng/μL Rnase純化水溶解沉淀，混勻后，4℃過(guò)夜。

② DNA 電泳檢測(cè)。

③ PCR 擴(kuò)增：18s引物序列： ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’； ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 反應(yīng)體系：H2O 17.8 μL、Buffer 3 μL、d NTP 2 μL、Primer1 3 μL、Primer2 3 μL、DNA 模板 1 μL、酶 0.2 μL、總體積 30 μL；反應(yīng)條件： 95℃ 5 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min、35 cycle；72℃ 10 min；12℃ forever；

④ 電泳 PCR 產(chǎn)物鑒定。

⑤ 上機(jī)測(cè)序，輸出峰圖。

北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病的發(fā)病癥狀

萼端黑斑病病原菌可在冬季潛伏，次年發(fā)病，庫(kù)爾勒香梨在生長(zhǎng)后期即可發(fā)病，采后貯藏期發(fā)病更為嚴(yán)重。發(fā)病癥狀為：發(fā)病初期，萼部果皮出現(xiàn)黑褐色斑塊，隨之硬化，病斑面積增大，無(wú)汁液產(chǎn)生，病斑最后呈現(xiàn)黑褐色凹陷。圖1

2.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)過(guò)劃線培養(yǎng)后，菌種的生長(zhǎng)狀態(tài)。圖2

挑取少量產(chǎn)孢菌絲體，置于無(wú)菌水載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征，觀察并記錄。顯微鏡下菌體具有明顯的分生孢子，褐色，卵圓形，3 d培養(yǎng)后菌落直徑可達(dá)100～120 mm。

顯微鏡下菌體具有明顯的分生孢子，褐色，卵圓形，3 d培養(yǎng)后菌落直徑可達(dá)100～120 mm。圖3

圖1 不同產(chǎn)地庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病果
Fig.1 The Korla pear Calyx end black spot disease fruits in different regions

圖2 菌種生長(zhǎng)狀態(tài)
Fig.2 The growth state of the fungus

圖3 顯微鏡下菌體形態(tài)特征
Fig.3 The morphological characteristics of the bacteria under the microscope

2.3 病原菌的rDNA-ITS分子標(biāo)記法鑒定

2.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物

研究表明，電泳條件：3 μL樣品+1%瓊脂糖凝膠，Marker 條帶組成：100 bp，250 bp，500 bp，750 bp，1 000 bp，2 000 bp，3 000 bp，5 000 bp。750 bp 條帶濃度為 60 ng/3 μL，顯示為加亮帶，其余條帶濃度均為 30 ng/3 μL。電泳方向從上向下。 圖4

圖4 病原菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖
Fig.4 Electrophoresis of pathogenic bacteria PCR

2.3.2 病原菌rDNA-ITS片段序列

測(cè)序結(jié)果：

阿克蘇產(chǎn)區(qū)庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原菌rDNA-ITS片段序列：

ACCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGC CTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAG CATATCAAAAGCCCGGAGGAA

巴州產(chǎn)區(qū)庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原菌rDNA-ITS片段序列：

CCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGGCTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA

2.3.3 blast 結(jié)果

① 阿克蘇產(chǎn)區(qū)的庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原菌與Alternaria alternata 的親緣關(guān)系最近。

② 巴州產(chǎn)區(qū)的庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原菌與 Alternaria alternata 的親緣關(guān)系最近。

分析比對(duì)阿克蘇地區(qū)和巴州地區(qū)庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原菌的rDNA-ITS序列，結(jié)果表明，以分離純化的病原菌DNA為模板，用真菌18s 引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的片段長(zhǎng)度分別為573和562 bp，通過(guò)blast 結(jié)果表明，阿克蘇地區(qū)和巴州地區(qū)庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原菌與Alternariaalternata菌親緣關(guān)系最近，因而確認(rèn)兩個(gè)主產(chǎn)區(qū)的庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原菌屬于同一菌屬。

3 討 論

Simmons等把產(chǎn)孢表型做為區(qū)分小孢子鏈格孢種的關(guān)鍵點(diǎn)[15]，而Peever等發(fā)現(xiàn)小孢子鏈格孢在形態(tài)上相近，建議將鏈格孢命名為 Aalternata 的不同致病型[16]。孫霞等[17]從對(duì)Alternaria小孢子種的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近看出，種的形態(tài)差異小，序列差異也小，親緣關(guān)系就越近。

通過(guò)對(duì)形態(tài)學(xué)和26S rDNA D1/D2序列的對(duì)比，能正確劃分鏈格孢屬之間的小孢子種，之前的學(xué)者鑒定這種致病菌為鏈格孢屬交鏈孢菌Alternariaalternate(Fr.)Keissl。形態(tài)學(xué)和比較形態(tài)學(xué)鑒定 rDNA-ITS序列，能客觀、迅速、便捷地鑒定真菌[18]。

賈曉輝等[4]從庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病健交界處果肉分離提取得到枝孢霉屬和鏈格孢屬，回接或混接至健康果后，沒(méi)有產(chǎn)生已知的發(fā)病癥狀。唐文娟通過(guò)對(duì)香梨黑頭病病原菌的致病性試驗(yàn)、形態(tài)學(xué)特征及rDNA-ITS分子標(biāo)記的鑒定，認(rèn)為黑頭病病原菌是真菌界半知菌亞門絲孢綱絲孢目暗色孢科枝孢屬多主枝孢菌[19]。上述兩者研究的結(jié)果與試驗(yàn)的結(jié)果不一致[6]。

4 結(jié) 論

從巴州和阿克蘇兩個(gè)主產(chǎn)區(qū)的果品冷庫(kù)采集到的庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病果上分離純化出相同菌落生長(zhǎng)形態(tài)一致的若干菌株，確定該菌是導(dǎo)致果實(shí)分別發(fā)病的病原菌。顯微鏡下菌體都具有明顯的分生孢子，褐色，卵圓形，3 d培養(yǎng)后菌落直徑可達(dá)100～120 mm。通過(guò)病原菌的r DNA-ITS分子標(biāo)記法鑒定，分析比對(duì)兩個(gè)病原菌的rDNA-ITS序列，以分離純化的病原菌DNA為模板，用真菌18s引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的片段長(zhǎng)度分別為573和562 bp，通過(guò)blast 結(jié)果表明，兩個(gè)病原菌與Alternariaalternata菌親緣關(guān)系最近。巴州產(chǎn)區(qū)和阿克蘇產(chǎn)區(qū)庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病的致病菌都是單一致病菌，并且形態(tài)學(xué)一致，屬于同一菌屬，最后鑒定萼端黑斑病致病菌為鏈格孢屬交鏈孢菌(Alternariaalternate(Fr.)Keissl)。

)

[1] 成磊.綠色優(yōu)質(zhì)庫(kù)爾勒香梨生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)的試驗(yàn)研究與示范[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2004.

CHENG Lei. (2004).StudyandDemonstrationonTheProductKeyTechnologyofGreenHighQualityofPyrusBretschneinDeriRehol[D]. Master Thesis. Northwest A & F University，Yangling. (in Chinese)

[2] 高啟明，李疆，李陽(yáng).庫(kù)爾勒香梨研究進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2005，23(1)：79-82.

GAO Qi-ming，LI Jiang，LI Yang. (2005). Literature Review of Researches on 'Kuerle Sweet Pear' [J].EconomicForestResearches，23(1)：79-82. (in Chinese)

[3] 李永才.蘋果梨(PyrusbretchneideriRehd.)黑斑病潛伏侵染及其預(yù)先合成抗菌物質(zhì)的變化和誘導(dǎo)[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2000.

LI Yong-cai. (2002).Applepears(PyrusbretchneideriRehd.)levelandthechangeoflatentinfectionanditssyntheticantimicrobialsubstancesinadvanceandinduction[D]. Master Thesis. Gansu Agricultural University，Lanzhou. (in Chinese)

[4] 賈曉輝，王文輝，李世強(qiáng)，等. 庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病發(fā)生的原因[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2010，27(4)：556-560.

JIA Xiao-hui，WANG Wen-hui，LI Shi-qiang，et al. (2010) .Causes of occurrence of the calys-end black spot on Korla fragrant pear [J].JournalofFruitScience， 27(4)：556-560. (in Chinese)

[5] 陳維維. 庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病病原學(xué)、發(fā)生規(guī)律和防治技術(shù)研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2014.

CHEN Wei-wei. (2014).StudyonEtiology，Regularity，PreventionandControltechnologyofthecalyxblackspotdiseaseofKorlaFragrantpear[D]. Master Thesis. Xinjiang Agricultural University，Urumqi.. (in Chinese)

[6] 趙曉梅. 庫(kù)爾勒香梨采后萼端黑斑病的發(fā)生機(jī)理與控制研究[D]. 烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2015.

ZHAO Xiao-mei. (2015). Studies on Mechanism and Control of Postharvest Black Spot on Calyx End in Korla Fragrant Pear [D]. Master Thesis. Xinjiang Agricultural University，Urumqi. (in Chinese)

[7] 趙曉梅，李疆，吳玉鵬，等. 不同處理對(duì)庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病抗性誘導(dǎo)的研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，37(4) ：333-338.

ZHAO Xiao-mei，LI Jiang，WU Yu-peng，et al. (2014). Research on Different Treatment in Induced Resistance to Calyx End Black Spot of Korla Pear [J].JournalofXinjiangAgriculturalUniversity， 37( 4) ：333-338. (in Chinese)

[8] 張峰，李世強(qiáng)，關(guān)軍鋒，等. 采后浸鈣對(duì)庫(kù)爾勒香梨果實(shí)Ca、Mg、K含量及萼端黑斑病的影響[J]. 中國(guó)園藝文摘，2014，(8)：1-2.

ZHANG Feng，LI Shi-qiang，GUAN Jun-feng，et al. (2014). Effects of calcium dipping after Harvest on Content of Ca，Mg，K and the calyx-end black spot of Korla fragrant Pear [J].ChineseHorticultureAbstracts，(8)：1-2. (in Chinese)

[9] 吳玉鵬，趙曉梅，葉凱，等. 鈣和1-MCP處理對(duì)庫(kù)爾勒香梨貯藏品質(zhì)和萼端黑斑病的影響[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，53(1)：9 -15.

WU Yu-peng，ZHAO Xiao-mei，YE Kai，et al. (2016).. Study on the Effect of Calcium and 1-MCP Synergy on Korla Pear Storage Quality [J].XinjiangAgriculturalSciences， 53(1)：9-15. (in Chinese)

[10] 吳玉鵬，趙曉梅. 庫(kù)爾勒香梨萼端黑斑病發(fā)病規(guī)律及生理變化的研究 [J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2016，37(17)：174-178.

WU Yu-peng，ZHAO Xiao-mei. (2016). Study on the Occurrence Regularity of Calyx End Black Spot and Physiological Changes in Korla Fragrant Pear [J].FoodResearchandDevelopment， 37(17)：174-178. (in Chinese)

[11] 許玲，李學(xué)文，騰康寧.果蔬采后致病真菌的檢測(cè)及其控制[J].食品科學(xué)，2003，24(7)：155-158.

XU Ling，LI Xue-wen，TENG Kang-ning. (2003). Detection and control of pathogenic fungi after fruit and vegetable postharvest [J].FoodScience，24(7)：155-158. (in Chinese)

[12] 楊克澤.南瓜葉枯病病原菌鑒定及品種抗病性研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2009.

YANG Ke-ze. (2009).IdentificationofPathogenCausingPumpkinLeafBlightandVarietyResistance[D]. Master Thesis. Gansu Agricultural University，Lanzhou. (in Chinese)

[13] 李寧，關(guān)文強(qiáng)，段雙科.葡萄采后致腐病原菌假定及侵染規(guī)律[J].果蔬保鮮與加工，2005，5(3)：38-39.

LI Ning，GUAN Wen-qiang，DUAN Shuang-ke. (2005). Idenfication and Infection Rule of Postharvest Pathogens for
Table Grapes Decay [J].StorageandProcess，5(3)：38-39. (in Chinese)

[14] 方中達(dá).植病研究方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979：25-31.

FANG Zhong-da. (1979).Researchmethodsofphytosis[M]. Beijing：Agricultural Press: 25-31. (in Chinese)

[15] 沈瑞清，張?zhí)煊? 培養(yǎng)基對(duì)鏈格孢屬(Alternaria Nees)真菌形態(tài)種級(jí)形態(tài)分類特征影響的研究[J].寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，24(3)：1-10.

SHEN Rui-qing，ZHANG Tian-yu. (2003). The relationship between media and species clacification characters of Alternaria Nees [J].JournalofNingxiaAgriculturalCollege，24(3)：1-10. (in Chinese)

[16] Peever, T. L., Su, G., Carpenterboggs, L., & Timmer, L. W. (2004). Molecular systematics of citrus-associated alternaria species.Mycologia,96(1): 119-134.

[17] 孫霞，張?zhí)煊? 河北鴨梨病果上鏈格孢分離系的形態(tài)及分子特性研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2008，27(1)：105-117.

SUN Xia，ZHANG Tian-yu. (2008). Morphological and molecular characterization ofAlternariaisolates on fruits ofPyrusbretchneideriRehd "Ya Li" [J].Mycosystema，27(1)：105-117. (in Chinese)

[18] 燕勇，李衛(wèi)平. RDNA-ITS序列分析在真菌鑒定中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18(10)：1 958-1 961.

YAN Yong，LI Wei-ping. (2008). Application of rDNA ITS sequence analysis in fungus identification [J].ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology， 18(10)：1,958-1,961. (in Chinese)

[19] 胡紅菊，王友平，甘宗義，等. 梨種質(zhì)資源對(duì)黑斑病的抗性評(píng)價(jià)[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002,(5)：113-115.

HU Hong-ju，WANG You-ping，GAN Zong-yi，et al. (2002). Study on the resistance to black spot disease of pear germplasm [J].HubeiAgriculturalSciences，(5)：113-115. (in Chinese)