棉花GhFAD2-1基因5’UTR內(nèi)含子的克隆與序列分析

孫 亮，文 鳳，劉 峰，張新宇，孫 杰

(石河子大學農(nóng)學院，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】在棉籽中，Δ12-油酸去飽和酶基因GhFAD2-1是控制油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶基因，對棉籽中多不飽和脂肪酸的含量與比例起著重要的調(diào)控作用[1]。GhFAD2-1上游序列所包含的調(diào)控元件等是對其組織特異性、作用強弱和時空表達進行精確調(diào)控的關(guān)鍵。對GhFAD2-1上游序列相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及調(diào)控作用的識別成為理解其表達機制的必要步驟。研究克隆并分析棉花GhFAD2-1上游5'UTR內(nèi)含子序列，對研究GhFAD2-1時空表達特性及調(diào)控的分子機制具有重要的意義。【前人研究進展】包括陸地棉(G.hirsutum)、海島棉(G.barbadense)、雷蒙德氏棉(G.raimondii)以及魯賓遜氏棉(G.robinsonii)等棉屬的FAD2-1基因的上游序列都含有一個位于5'非翻譯區(qū)(5'UTR)的內(nèi)含子[2]；GhFAD2-1的啟動子序列則位于該5'UTR內(nèi)含子的上游，由于GhFAD2-1的上游區(qū)域含有內(nèi)含子，所以增加了其表達調(diào)控的復雜性。一直以來對其調(diào)控序列研究的不夠深入?；蚓幋a區(qū)的上游序列在很大程度決定著目的基因表達的時間、空間和強度。內(nèi)含子是基因組中的一種重要元件，其對轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達水平起著重要的調(diào)控作用[3-4]。從目前已有的研究結(jié)果中，尚不能準確判定GhFAD2-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點，5'UTR區(qū)內(nèi)含子的剪切位點，其具體堿基序列及片段長度等。【本研究切入點】農(nóng)業(yè)生產(chǎn)栽培的棉花主要是四倍體的陸地棉(G.hirsutum)，其基因組AADD數(shù)據(jù)及相關(guān)基因編碼序列等已經(jīng)公布在棉花基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.cottongen.org)、NCBI等中，為研究進行序列比對分析奠定基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究基于陸地棉GhFAD2-1基因編碼區(qū)序列，設(shè)計特異性引物，通過進行5' RACE 擴增，獲得完整的GhFAD2-1非翻譯區(qū)(5'UTR)全長序列。通過結(jié)合5'-RACE獲得GhFAD2-1基因的5'-端核苷酸序列與基因組擴增GhFAD2-1序列進行比較，獲得GhFAD2-1基因5'-端UTR區(qū)域內(nèi)的內(nèi)含子序列，并對其進行作用原件分析，為進一步研究GhFAD2-1基因的表達與調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 +材 料

棉花(Gossypiumhirsutum)品種新陸早33號、大腸桿菌菌株E.coliDH5α等均為實驗室保存。克隆載體pMD18-T、ExTaqDNA聚合酶、Clontech SMART RACE cDNA Amplification Kit、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker等購自大連寶生物公司。DNA凝膠回收試劑盒、Plant RNA快速提取試劑盒(離心柱型)等購自天根生化有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)和進口分析純。

1.2 方 法

1.2.1 5'-RACE獲得GhFAD2-1基因的5'-端

取新陸早33號花后15 d的棉花種子，去除外層軟殼后，將棉仁在研缽中用液氮冷激后快速研磨，將粉末快速裝入RNase-free的離心管中，保證樣品不溶解，并讓液氮揮發(fā)，采用高純總RNA快速提取試劑盒提取總RNA。

根據(jù)GenBank中已報道的棉花GhFAD2-1基因編碼區(qū)的序列信息，利用Primer Premier 6設(shè)計特異性擴增引物FAD2-1-R: 5'-GGATGCAACCTTGGAGAACC-3'；引物由上海生工公司合成。參照Clontech SMART RACE cDNA Amplification Kit說明，合成獲得5'-RACE-Ready cDNA。以5'-RACE-Ready cDNA為模板，以已設(shè)計的特異性引物FAD2-1-R和5'-RACE Kit 中提供的UPM引物組成配對引物，進行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中，3 V/cm電泳45 min后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀測目的條帶。獲得清晰的預期目標條帶，進行膠回收。膠回收操作步驟參照天根生物公司膠回收試劑盒說明書。參照Takara公司pMD18-T Vector試劑盒說明將回收目的片段連接到pMD18-T Vector上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選抗Amp菌落，同時進行菌落PCR鑒定。挑選6個PCR陽性克隆送華大基因公司測序。

1.2.2GhFAD2-1基因的5'-端UTR內(nèi)含子克隆與序列分析

以5'-RACE獲得GhFAD2-1基因的5'-端核苷酸序列為基礎(chǔ)：以轉(zhuǎn)錄起點處設(shè)計PCR特異性擴增上游引物；以翻譯起始點處設(shè)計PCR特異性擴增下游引物。應(yīng)用植物基因組提取試劑盒提取新陸早33號葉片基因組DNA。以新陸早33號基因組DNA為模板，進行PCR反應(yīng)；PCR 產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中，3 V/cm 電泳45 min 后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀測目的條帶。膠回收、PCR鑒定等方法同上。挑選6個PCR陽性克隆送華大基因公司測序。

對比分析5'-RACE獲得GhFAD2-1基因的5'-端核苷酸序列與上述基因組擴增的特異序列，鑒定出GhFAD2-1基因的5'-端UTR區(qū)域內(nèi)的內(nèi)含子序列，并對其進行生物信息學分析。順式作用元件采用http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/以及http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/在線分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhFAD2-1基因5端序列的克隆

應(yīng)用高純總RNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取獲得高質(zhì)量的總RNA(圖1)；采用Clontech SMART RACE cDNA Amplification Kit將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增，在350 bp左右出現(xiàn)目標條帶(圖2)。取PCR陽性克隆進行測序。測序結(jié)果表明，cDNA擴增出兩條序列，片段大小為362 bp。與GhFAD2-1基因編碼區(qū)序列(GenBank: HQ259410)有285 bp 的重疊片段，表明GhFAD2-1基因5'端非翻譯區(qū)(5'-untranslated region, 5'-UTR)長77 bp，轉(zhuǎn)錄的起點堿基為T(圖3)。圖1～3

圖1 新陸早33號提取的總RNA檢測
Fig.1 The detection of total RNA of xinluzao33

圖2 5'-RACE擴增目標序列
Fig.2 5'-RACE technique of target sequence

圖3 5'-RACE獲得GhFAD2-1基因的5'-端序列
Fig.3 The 5'- end sequence of GhFAD2-1 was obtained by 5'-RACE technique

2.2GhFAD2-1基因5'UTR內(nèi)含子克隆及序列

以新陸早33號基因組DNA為模板，以5'-RACE獲得GhFAD2-1基因的5'-端核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄起點為基礎(chǔ)設(shè)計的特異性上游引物FAD2-1-5F: 5'-TCGCCCAAAACCAACACGCCT-3'；以翻譯起始點處設(shè)計特異性擴增下游引物FAD2-1-5R: 5'-CATCCTACCACCGGCACC-3'。PCR擴增產(chǎn)物電泳顯示約在1 200 bp左右出現(xiàn)特異性條帶(圖4)。采用T-A克隆方法將PCR產(chǎn)物與pMD18-T連接、轉(zhuǎn)化；6個PCR陽性克隆測序表明，所克隆獲得的片段分成了兩類：有4個克隆序列完全一致，片段全長為1 209 bp；另外2個克隆序列完全一致，片段全長為1 201 bp；兩者有174個堿基差異(圖5)。由于棉花是異源四倍體(AADD基因組)；研究表明，擴增獲得的高度同源的片段可能分別來源于A或D基因組。進一步對比棉花基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.cottongen.org)中的GhFAD2-1基因組的序列進行分析；結(jié)果表明，片段全長為1 201 bp與棉花基因組數(shù)據(jù)庫中Gh_A13G1850(GhFAD2-1)的序列相吻合，表明該序列來源于A基因組。片段全長為1 209 bp與棉花基因組數(shù)據(jù)庫中Gh_A13G1850(GhFAD2-1)的序列存在較多的堿基差異，推測其可能來源于D基因組。將其于棉花基因組數(shù)據(jù)庫中Gh_D13G2238(GhFAD2-1)的序列進行對比分析；研究表明，兩者的序列與較好的一致性，表明所克隆的1 209 bp序列來源于D基因組。值得注意的是，通過1 209 bp序列與基因組數(shù)據(jù)庫中GhFAD2-1(Gh_D13G2238)的5'序列對比分析表明，棉花基因組數(shù)據(jù)庫中Gh_D13G2238(GhFAD2-1)基因的上游出現(xiàn)冗余重復信息(位于起始密碼子上游-1 880 bp～-693 bp)，該序列全長1 187 bp；綜合GhFAD2-1的5'RACE與基因組擴增研究結(jié)果，可以判定棉花基因組數(shù)據(jù)庫中Gh_D13G2238(GhFAD2-1)基因上游的序列在基因組測序時或基因組組裝過程中，出現(xiàn)了錯誤。當將棉花基因組數(shù)據(jù)庫中Gh_D13G2238(GhFAD2-1)基因的上游的錯誤重復冗余1 187 bp序列刪除后，其序列就與所克隆獲得的片段全長為1 209 bp的序列完全一致。

結(jié)合5'-RACE獲得GhFAD2-1基因的5'-端核苷酸序列與基因組擴增獲得序列，進一步分析比較。研究表明，位于A基因組的GhFAD2-1基因5'-端UTR區(qū)域內(nèi)的內(nèi)含子序列全長1 103 bp；位于D基因組的GhFAD2-1基因5'-端UTR區(qū)域內(nèi)的內(nèi)含子序列全長1 111 bp(圖5)。A和D基因組的GhFAD2-1基因5'-端UTR區(qū)域內(nèi)的內(nèi)含子的剪切位點相同，5'-端UTR內(nèi)含子兩個剪切位點分別AA-GG、CA-GC。這表明，該內(nèi)含子剪切位點不具有GT-AG規(guī)則，并且序列中富含AT，其剪切位點可能為一新的剪切方式。

使用PlantCARE 在線分析克隆到的GhFAD2-1 5'-端UTR內(nèi)含子序列的順式作用元件，結(jié)果表明，在A基因組和D基因組序列中都具有與激素相關(guān)的作用原件：乙烯應(yīng)答元件ERE(ATTTCAAA)和赤霉素響應(yīng)元件P-box(CCTTTTG)，以及脅迫等相關(guān)的作用元件，如干旱誘導元件MBS(TAACTG)、防御和應(yīng)激反應(yīng)元件TC-rich repeats(ATTTTCTTCA)等。GhFAD2-1 5'-端UTR內(nèi)含子序列還含有與光響應(yīng)相關(guān)的作用元件Box I(TTTCAAA)、GT1-motif(GGTTAA)、ATCT-motif(AATCTAATCC)等。在A基因組和D基因組序列中都還具有種子特異的表達元件GCN4_motif(CAAGCCA)，這也與GhFAD2-1在種子優(yōu)勢表達這一組織特異性表達相一致。此外，在D基因組中，GhFAD2-1 5'-端UTR內(nèi)含子序列還包含高效轉(zhuǎn)錄作用元件5UTR Py-rich stretch(TTTCTCTCTCTCTC)。GhFAD2-1 5'-端UTR內(nèi)含子序列包含的主要順式作用元件及其在內(nèi)含子序列上的位置。圖4，圖5，表1

圖4 PCR擴增目標序列
Fig.4 PCR amplification of target sequence

注：5'UTR_intron_A: 棉花D基因組GhFAD2-1基因5'-UTR及內(nèi)含子； 5'UTR_intron_D: 棉花D基因組GhFAD2-1基因5'-UTR及內(nèi)含子紅色字體為堿基差異；加粗字體為起始密碼子；下劃線為基因組PCR擴增相對應(yīng)的引物序列；aaGG、CAgc分別為5'-端UTR內(nèi)含子兩個剪切位點

Note: 5'UTR_intron_A: 5'- terminal UTR and intron sequence of GhFAD2-1from a A-genome cotton; 5'UTR_intron_D: 5'- terminal UTR and intron sequence of GhFAD2-1from a D-genome cotton; Red fonts represents base differences; The bold font represents the start codon; The underline is the sequence corresponding to the primers; The aaGG and CAgc are two 5'- terminal UTR intron splice site, respectively

圖5 GhFAD2-1基因5'-端UTR及內(nèi)含子
Fig.5 5'-UTR and intron sequence of GhFAD2-1

表1 GhFAD2-1 5'UTR內(nèi)含子區(qū)順式調(diào)控元件
Table 1 The cis regulatory elements of GhFAD2-1 5'UTR intron

順式作用原件序列位置5＇-UTRintron-A5＇-UTRintron-DERE乙烯應(yīng)答元件ATTTCAAA539581/608P-box赤霉素響應(yīng)元件CCTTTTG117/852113/860BoxI光響應(yīng)元件TTTCAAA540/636/766582/609/774GT1-motif光響應(yīng)元件GGTTAA797730ATCT-motif光響應(yīng)元件AATCTAATC(C/T)423/446/TC-richrepeats參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的ATTTTCTTCA16940/1019HSE熱應(yīng)激反應(yīng)作用元件AAAAAATTTC/711MBSMYB結(jié)合位點參與干旱誘導TAACTG110106GCN4＿motifCAAGCCA8738815UTRPy-richstretch高效轉(zhuǎn)錄作用元件TTTCTCTCTCTCTC/13ARE用于厭氧誘導的調(diào)節(jié)元件TGGTTT275/10266

3 討 論

研究基于陸地棉GhFAD2-1基因編碼區(qū)序列，通過進行5' RACE 擴增，結(jié)合基因組PCR擴增序列進行比較，分別克隆獲得了A、D基因組的GhFAD2-1基因5'UTR內(nèi)含子序列。通過序列比對分析，發(fā)現(xiàn)了D基因組GhFAD2-1基因基因的上游出現(xiàn)冗余重復信息(位于起始密碼子上游-1 880 bp～-693 bp)，該序列全長1 187 bp，可能是由于基因組測序或組裝過程中導致的錯誤冗余信息?？寺～@得的內(nèi)含子序列富含AT，對棉花GhFAD2-1基因5'UTR內(nèi)含子區(qū)順式調(diào)控元件進行分析，發(fā)現(xiàn)其包括一些典型的與光響應(yīng)相關(guān)的作用元件如Box I(TTTCAAA)、GT1-motif(GGTTAA)等；以及與激素(乙烯、赤霉素)和脅迫因素相關(guān)的應(yīng)答元件等。這也與相關(guān)研究認為棉花等植物的FAD2基因的轉(zhuǎn)錄水平受到多種激素和非生物脅迫等因素的影響相一致[4-7]。

內(nèi)含子是基因組中的一種重要元件，在許多植物中都已證實內(nèi)含子的存在可以顯著增強基因的轉(zhuǎn)錄效率，如在單子葉植物中能夠提高基因表達量的內(nèi)含子有來自玉米的Adh1、Sh1、Bz1、Hsp82、Actin、Ubi1和GapA1基因等[8-10]和來自水稻的SalT、Act1、OsTubA1和OsCDPK2基因等[11-12]；在雙子葉植物中可以提高表達量的內(nèi)含子有來自矮牽牛的RbcS基因[13]和馬鈴薯的ST-LS1基因等[14]。內(nèi)含子介導的增強效應(yīng)一般在2～10倍左右，有的甚至可提高基因表達100倍以上[11]。尤其是當內(nèi)含子位于轉(zhuǎn)錄本5'UTR時，可以顯著增強基因的轉(zhuǎn)錄效率[15]。同時，不同內(nèi)含子對同一基因表達增強的程度不同，玉米Shl基因的內(nèi)含子1可以使報告基因表達水平增強40倍，而玉米Adhl基因的內(nèi)含子1使報告基因的表達水平僅提高4倍。Adhl基因的內(nèi)含子2和6均能不同程度的增強報告基因的表達水平，但內(nèi)含子9卻不能[16]。對于研究獲得的棉花GhFAD2-1的5'UTR內(nèi)含子是否發(fā)揮轉(zhuǎn)錄增強子的功能，其對所調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄程度的影響如何，仍有待于進一步研究。此外，D基因組5'UTR內(nèi)含子序列中，具有高效轉(zhuǎn)錄作用元件5UTR Py-rich stretch，對于棉花GhFAD2-1在棉籽中是否是D亞組表達量高于A亞組表達量，也有待于進一步分析。對棉花GhFAD2-1基因的上游的調(diào)控序列的克隆研究，有助于進一步在分子水平上研究GhFAD2-1基因功能及其表達調(diào)控規(guī)律，進而為植物的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

研究利用5'RACE技術(shù)，克隆獲得棉花Δ12-油酸去飽和酶基因GhFAD2-1的5'UTR序列：GhFAD2-1成熟mRNA的5' UTR為77 bp；通過進一步分析棉花基因組序列，進而再利用PCR技術(shù)克隆獲得GhFAD2-1的5'UTR內(nèi)含子序列：在棉花的A、D基因組中，GhFAD2-1的5' UTR中各含有一個全長分別為1 103 bp、1 111 bp的內(nèi)含子序列；其轉(zhuǎn)錄的起點堿基為T；5' UTR內(nèi)含子兩個剪切位點分別AA-GG、CA-GC。作用元件分析表明，內(nèi)含子包括一些典型的與光響應(yīng)相關(guān)的作用元件，以及與激素和脅迫因素相關(guān)的應(yīng)答元件等。該研究的結(jié)果為進一步在分子水平上研究GhFAD2-1功能及其表達調(diào)控規(guī)律，進而為植物的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。

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