利濕通痹湯及其拆方對高尿酸血癥合并急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠療效機(jī)制研究

秦一鳴，楊帆，馬雙雙，張懿鵬，張發(fā)艷

(山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355)

高尿酸血癥是因嘌呤代謝紊亂所引起的代謝性疾病。近年來其發(fā)病率逐年升高，已成為僅次于糖尿病的第二大代謝類疑難病[1-2]。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎為高尿酸血癥最常見的并發(fā)癥，也是患者就診的最普遍原因。中醫(yī)藥治療高尿酸血癥與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有顯著優(yōu)勢，針對其病機(jī)的多角度方藥篩選已引起廣泛關(guān)注[3-4]。本研究將利濕通痹湯及其拆方應(yīng)用于高尿酸血癥合并GA大鼠模型，旨在探討可能存在的中醫(yī)證候特點(diǎn)和藥理機(jī)制，為提高該病臨床診治水平提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Wistar大鼠42只，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，動物許可證編號：SCXK(魯)20130001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

利濕通痹湯(當(dāng)歸、紅花、桃仁、川芎、防風(fēng)、黃柏、蒼術(shù)、獨(dú)活、羌活、茵陳、澤瀉)及其拆方——祛風(fēng)通經(jīng)方(獨(dú)活、羌活、防風(fēng))、清熱利濕方(黃柏、蒼術(shù)、澤瀉、茵陳)、活血化瘀方(當(dāng)歸、紅花、桃仁、川芎)。所用藥物購自安徽亳州浙皖中藥飲片有限公司，加水煎煮兩次后混勻，旋蒸濃縮至濃度為0.5 g/mL備用。

對照用藥：吲哚美辛，山西云鵬制藥，批號A141002；別嘌醇片，重慶青陽藥業(yè)有限公司，批號141101。

1.3 試劑與儀器

腺嘌呤(批號X02J6M1)、尿酸鈉晶體(批號BCBH7155V)、吐溫80(批號Z12D5Y13)；IL-1β ELISA檢測試劑盒(批號20150601A)、尿酸檢測試劑盒(批號L12O6G4230)(上海源葉生物科技有限公司)；XOD測定試劑盒(批號20150917,南京建成生物工程研究所)；酶標(biāo)儀(美國Biotok公司,型號EL340i)；低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，型號SC-3612)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠，型號RE-52A)；紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司，型號UV-5500)。

1.4 模型制備

1.4.1 高尿酸血癥模型制備

參照文獻(xiàn)[5]，采用腺嘌呤200 mg/(kg·d)和鹽酸乙胺丁醇250 mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)7 d。

1.4.2 GA模型制備

于高尿酸血癥造模結(jié)束后，將1 g尿酸鈉加入0.9%生理鹽水40 ml中，再加入10 mL吐溫80，加溫?cái)嚢瑁瞥?0 g/L的尿酸鈉溶液。將各組大鼠以水合氯醛麻醉，除對照組外，用注射器于右側(cè)踝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)與脛骨呈45°穿刺入關(guān)節(jié)腔，注入尿酸鈉溶液50 μL，伸屈、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動10 min。注射后大鼠出現(xiàn)跛行及關(guān)節(jié)紅腫發(fā)熱，證明造模成功。對照組予以50 μL生理鹽水關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射。

1.5 分組與給藥

以60 kg體表面積用藥量換算后劑量的6倍為給藥劑量，將大鼠分為對照組、模型組、利濕通痹湯全方組(13.2 g/kg)、祛風(fēng)通經(jīng)組(3.9 g/kg)、清熱利濕組(5.1 g/kg)、活血化瘀組(4.2 g/kg)、西藥組(別嘌醇0.09 g/kg，吲哚美辛0.015 g/kg)，每組6只，各組灌胃容積均為3 ml。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，對照組、模型組給予生理鹽水，各給藥組予以相應(yīng)藥物(西藥組給予別嘌醇)連續(xù)灌胃。7 d后，模型組與各給藥組以腺嘌呤聯(lián)合鹽酸乙胺丁醇制備高尿酸血癥模型，上午給藥干預(yù)，下午給藥造模，繼續(xù)灌胃7 d。于高尿酸血癥造模第6天，除對照組外，各組大鼠制備GA模型，同時西藥組別嘌醇改作吲哚美辛灌胃，2 d后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 關(guān)節(jié)周徑測量

于GA造模后第24 h以縛線法測量右側(cè)踝關(guān)節(jié)同一部位周徑(取均值)，評估其關(guān)節(jié)腫脹度。

1.6.2 血清生化指標(biāo)測定

給藥結(jié)束后，各組大鼠以水合氯醛麻醉，腹腔靜脈采血，靜置4 h，3 500 r/min離心15 min，取上清檢測血尿酸值、XOD活力與IL-1β水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 利濕通痹湯及其拆方對高尿酸血癥合并GA大鼠關(guān)節(jié)周徑的影響

關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射尿酸鈉后，各組大鼠關(guān)節(jié)均見明顯腫脹，關(guān)節(jié)周徑增大。模型組與對照組相比有顯著差異(P<0.01)，證明大鼠GA模型造模成功。在造模后第24 h，全方組、清熱利濕組與活血化瘀組可降低大鼠關(guān)節(jié)周徑(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見表1。

表1 對高尿酸血癥合并GA大鼠關(guān)節(jié)周徑的影響

注：與模型組相比，[1]P<0.05，[2]P<0.01

2.2 利濕通痹湯及其拆方對高尿酸血癥合并GA大鼠血清UA、XOD的影響

與對照組相比，模型組大鼠血清UA值及XOD活力顯著升高(P<0.01)，證明大鼠高尿酸血癥模型造模成功。與模型組相比，全方組、祛風(fēng)通經(jīng)組、清熱利濕組與活血化瘀組可明顯降低大鼠血清UA值；全方組、祛風(fēng)通經(jīng)組、清熱利濕組可抑制血清XOD活力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 對高尿酸血癥合并GA大鼠血清UA值及XOD活力的影響

注：與模型組相比，[1]P<0.05，[2]P<0.01

2.3 利濕通痹湯及其拆方對高尿酸血癥合并GA大鼠血清IL-1β水平的影響

制備GA大鼠模型2 d后，模型組大鼠血清IL-1β水平較正常組顯著上升(P<0.01)。全方組、祛風(fēng)通經(jīng)組、清熱利濕組與活血化瘀組均可抑制其血清IL-1β水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見表3。

表3 對高尿酸血癥合并GA大鼠血清IL-1β水平的影響

注：與模型組相比，[1]P<0.05，[2]P<0.01

3 討論

作為人類嘌呤代謝的終產(chǎn)物，尿酸在體內(nèi)的主要來源為核酸分解或機(jī)體內(nèi)合成(約占人體總尿酸的80%)[6]。次黃嘌呤與黃嘌呤是體內(nèi)產(chǎn)生尿酸的直接前體，次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶作用下被氧化為黃嘌呤,進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為尿酸。因此XOD是體內(nèi)核酸代謝的關(guān)鍵酶，XOD的活性直接影響體內(nèi)尿酸水平[7]。尿酸鹽可在血尿酸濃度過高時沉積于關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍，刺激局部組織釋放大量炎癥介質(zhì)，引發(fā)GA。其中IL-1在諸多細(xì)胞因子中占據(jù)重要地位，而其在關(guān)節(jié)內(nèi)的主要存在形式為IL-1β[8]。作為前炎癥網(wǎng)鏈中的一級細(xì)胞因子，IL-1β是調(diào)節(jié)炎癥的始動因素[5]，由IL-1β介導(dǎo)的級聯(lián)瀑布效應(yīng)可造成廣泛的細(xì)胞與組織損傷，反復(fù)的GA發(fā)作可最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨基質(zhì)與骨質(zhì)的破壞性病變[9]。高尿酸血癥與GA關(guān)系密切，有文獻(xiàn)表明，5%～12%的高尿酸血癥患者最終發(fā)展為痛風(fēng)[10]?？梢妼τ谶@一疾病，降低體內(nèi)尿酸值、減輕關(guān)節(jié)炎癥為其治療核心。

“高尿酸血癥”一詞在中醫(yī)古典文獻(xiàn)中未有提及，有學(xué)者認(rèn)為其隸屬于“濕毒”范疇。而從臨床表現(xiàn)看，GA則與“白虎歷節(jié)”“痛風(fēng)”“熱痹”等相近[11]。一般認(rèn)為，該病的起病在于過食肥甘厚味，日久損傷脾胃以致運(yùn)化失司，濕邪停聚，郁而化熱；或先天不足、年老體衰導(dǎo)致肝、脾、腎虧虛，無力運(yùn)化水濕進(jìn)而內(nèi)生濕熱。濕熱阻滯既久，則經(jīng)脈不得濡養(yǎng)而致痰瘀叢生。痰凝關(guān)節(jié)，瘀阻經(jīng)脈，結(jié)為窠臼，終成痹阻。在本病的治療上，向黎黎歸納統(tǒng)計(jì)了近10年間臨床治療痛風(fēng)有效的的相關(guān)方藥，發(fā)現(xiàn)其主要著眼于清熱利濕、活血化瘀和祛風(fēng)化濕[12]。故濕濁內(nèi)蘊(yùn)是高尿酸血癥合并GA的病理基礎(chǔ)，由此引發(fā)的病理產(chǎn)物及病理狀態(tài)構(gòu)成該病較為復(fù)雜的病機(jī)。從方劑學(xué)的角度探索其治療原則、組方規(guī)律及作用機(jī)制，具有重要的研究價值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利濕通痹湯及其三組拆方對高尿酸血癥合并GA大鼠模型均有不同程度的治療作用，但在藥理機(jī)制上各有側(cè)重。清熱利濕組血清IL-1β值、XOD活力均低于祛風(fēng)通經(jīng)組與活血化瘀組，說明清熱利濕類藥物具有較強(qiáng)的降低尿酸水平、抑制炎癥反應(yīng)作用，亦反證“濕熱”為該模型主要的中醫(yī)證候特點(diǎn),與一些學(xué)者的觀點(diǎn)相似[7,13]?；钛鼋M藥物可降低血清UA及IL-1β值，但對XOD的抑制作用較弱，推測其可能是通過促進(jìn)尿酸排泄等途徑從而改善血尿酸濃度的。祛風(fēng)通經(jīng)組藥物雖可顯著降低模型大鼠血清尿酸及IL-1β水平，但不能改善臨床癥狀(關(guān)節(jié)周徑)，提示臨床治療GA不能僅考慮炎癥反應(yīng)的控制，還應(yīng)配伍其他治法。利濕通痹湯全方可明顯降低模型大鼠血清尿酸及IL-1β值、抑制XOD活力，且較三組拆方為優(yōu)，說明三組治法可產(chǎn)生較好的協(xié)同作用，臨床上可同時應(yīng)用以增強(qiáng)療效。

綜上所述，利濕通痹湯及其拆方對高尿酸血癥合并GA有良好的治療作用，其作用可能是通過降低血清IL-1β、UA水平及抑制XOD活力而實(shí)現(xiàn)的。本研究在臨床資料及動物實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)分析的基礎(chǔ)上，將利濕通痹湯及其拆方應(yīng)用于動物模型并觀察相關(guān)指標(biāo)的改變，以藥物反證的形式歸納該模型的主要中醫(yī)證候、病機(jī)特點(diǎn)，并探討不同治法下的代表藥物可能存在的藥理機(jī)制，從方劑配伍角度為臨床應(yīng)用提供了一定程度上的理論依據(jù)。但關(guān)于本方治療高尿酸血癥合并GA的其他藥理機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

[1] 齊新宇,董大立,熊輝,等.蠲痹歷節(jié)清方治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱證療效觀察[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,34(5):42-44.

[2] 向黎黎,熊輝,李騰龍,等.蠲痹歷節(jié)清方治療急性期濕熱蘊(yùn)結(jié)型痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎31例[J].湖南中醫(yī)雜志,2015,31(2):14-16.

[3] 陳光亮，周媛鳳，張穎.治療痛風(fēng)和高尿酸血癥藥物研究進(jìn)展[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2017，22(1)：104-109.

[4] 楊博,晏和國,李建洪,等.從“脾虛濕阻”分期論治痛風(fēng)[J].中醫(yī)藥信息,2018,35(1):79-81.

[5] 徐莎婷,榮譽(yù),吳楊,等.當(dāng)歸拈痛湯及其拆方對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血尿酸值、IL-1β、TNF-α、COX-2 的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,33(9):44-47.

[6] 劉洋.殼寡糖對小鼠高尿酸血癥動物模型的治療作用研究[D].青島:中國海洋大學(xué),2009:1-60.

[7] 高碧珍,康潔,閔莉,等.不同中醫(yī)治法對高尿酸血癥合并高脂高糖大鼠模型黃嘌呤氧化酶及其mRNA表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2010,25(11):1793-1795.

[8] LANDSBERG R,TAKEUCHI E,PUZAS J E.Different activation by cytokines of mitogen-activated protein kinases in bovinetemporoman dibular-joint disc cells [J]. Arch Oral Biol,1999,44(1):41.

[9] MYTHILYPRIYA R,SACHDANANDAM P S,Sachdanandam P.Ameliorating effect of Kalpaamruthaa,a Siddha preparation in adjuvant induced arthritis in rats with reference to changes in proinflammatory cytokines andacute phase proteins[J].Chem Biol Interact,2009,179(2-3):335-343.

[10] 蔣明,朱立平,林孝義.風(fēng)濕病學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1995:1470-1476.

[11] 謝志軍,溫成平,鮑海軍,等.祛濁通痹方對高尿酸模型大鼠血尿酸及黃嘌呤氧化酶的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(6):1398-1400.

[12] 向黎黎.中醫(yī)藥治療痛風(fēng)用藥規(guī)律及證型特點(diǎn)的文獻(xiàn)研究[D].長沙:湖南中醫(yī)藥大學(xué),2015:1-37.

[13] 陸艷萍,舒榮,崔劉福.補(bǔ)腎健脾利濕法治療高尿酸血癥臨床觀察[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2005,11(7):557.