黑果枸杞對(duì)大鼠抗焦慮作用的研究及對(duì)海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

馬曉杰，陳軼，劉潔，藺明煊，郭建友，石晉麗*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.中國(guó)科學(xué)院心理研究所心理健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101)

黑果枸杞(LyciumrutheniumMurray.)屬茄科枸杞屬植物，以干燥成熟果實(shí)入藥，在《晶珠本草》《四部醫(yī)典》等藏醫(yī)藥學(xué)經(jīng)典著作中均有記載，現(xiàn)多為西藏、青海和新疆民間藥用或食用?！毒е楸静荨穂1]中認(rèn)為其性平、味甘，功效清心熱，主治心臟病和婦科病。

國(guó)內(nèi)外研究表明，黑果枸杞的藥效成分主要為花色苷類天然色素，且含量遠(yuǎn)高于常見(jiàn)的花色苷來(lái)源植物如紫薯、藍(lán)莓以及葡萄等[2-5]。花色苷類天然色素具有出色的抗氧化和清除自由基能力[5-8]，以及抗炎、抗癌、預(yù)防心血管疾病、預(yù)防神經(jīng)退行性疾病和改善認(rèn)知、提高記憶力等作用[9-12]。其中對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用、預(yù)防治療腦部神經(jīng)官能癥的研究正逐漸成為熱點(diǎn)。單胺氧化酶(MAO)活性的升高一直與抑郁、焦慮和神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，Dreiseite等通過(guò)研究花青素，原花青素和酚類代謝產(chǎn)物對(duì)MAO的抑制作用，推測(cè)了花青素及花色苷的新興神經(jīng)保護(hù)作用，表明其具有治療抑郁癥、焦慮癥和退行性疾病的潛力[13]。黑果枸杞富含花色苷類成分，具有治療焦慮癥、抑郁癥及其他一系列腦部神經(jīng)癥的潛力。因此，本文主要探討黑果枸杞的抗焦慮作用及其與海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系。

1 材料

1.1 藥材與樣品制備

黑果枸杞果實(shí)采自青海省都蘭縣，果期2015年6月；黑果枸杞提取物實(shí)驗(yàn)室自制。150 g黑果枸杞干燥果實(shí)粉碎后用1.5 L石油醚過(guò)夜浸泡脫脂，3.75 L 80%乙醇(含2%甲酸)50℃水浴避光浸提2次，每次3 h。50℃真空旋蒸除去乙醇，過(guò)AB-8大孔樹(shù)脂，80%乙醇(含2%甲酸)洗脫，50℃真空旋蒸除去乙醇，冷凍干燥得12.062 5 g年取物，得率為8.04%。pH示差法測(cè)提取物中花色苷含量，以錦葵素-3-O葡萄糖苷計(jì)為(5.76±0.06) mg/100 mg。折合生藥中含量為(463.13±4.86) mg/100 g(dw)。

1.2 動(dòng)物

SD雄性大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(160±10)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)(2015-0012)。

1.3 試劑與儀器

地西泮(DZP，北京益民藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H11020898)；氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H13023200)；羧甲基纖維素鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20110805)；5-HT、DA(美國(guó)SIGMA公司)；甲醇(色譜級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司)；二正丁胺(BAS進(jìn)口分裝);乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、乙酸鈉(分析純，上?；瘜W(xué)試劑廠)；高氯酸、B8離子對(duì)試劑(天津化學(xué)試劑二廠)。

高架十字迷宮(AES-M02型，AVTAS 3.0軟件)；曠場(chǎng)設(shè)備；Alliance 2695高效液相色譜儀(ECD 2465檢測(cè)器)；超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(JY88-ⅡN，寧波新芝生物科技有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(SORVALL Stratos,Thermo science)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DE型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；電子分析天平(MA240D型, 上海博通醫(yī)用儀器廠)；精密pH計(jì)(PHS-3B，上海光學(xué)儀器廠)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與處理

大鼠單籠飼養(yǎng)，隨機(jī)分組：空白組、陽(yáng)性藥物組(DZP組)、黑果枸杞提取物低劑量組、中劑量組、高劑量組。其中藥物低、中、高劑量組分別按0.6 g/(kg·d)、1.2 g/(kg·d)和2.4 g/(kg·d)給予灌胃，DZP組給予1.0 mg/(kg·d)灌胃，空白組灌服等容積的生理鹽水，連續(xù)7 d灌胃給藥。于第7 d，中藥組、空白組末次給藥1 h后，DZP組灌胃0.5 h后，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試，測(cè)試完畢，立即取材。

2.2 大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)

半徑90 cm，高60 cm的圓形曠場(chǎng)(半徑45 cm的圓形區(qū)域內(nèi)稱為中央?yún)^(qū))，每只大鼠在測(cè)試前，任其在動(dòng)物盒中自由活動(dòng)5 min，然后迅速轉(zhuǎn)移至?xí)鐖?chǎng)開(kāi)場(chǎng)邊緣區(qū)，由視頻跟蹤系統(tǒng)自動(dòng)記錄5 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況。記錄指標(biāo)為大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)及停留的時(shí)間。

2.2.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(EPM)

實(shí)驗(yàn)室室溫20 ℃左右，保持安靜，以動(dòng)物燈照明。每只大鼠在測(cè)試前，任其在動(dòng)物盒中自由活動(dòng)5 min，然后迅速轉(zhuǎn)移至高架十字迷宮的中央平臺(tái)處，由視頻跟蹤系統(tǒng)自動(dòng)記錄5 min內(nèi)大鼠進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)(Open arm entry, OE)和停留時(shí)間(Open arm time，OT)，進(jìn)入閉臂的次數(shù)(Close arm entry, CE)和停留時(shí)間(Close arm time, CT)。焦慮行為指標(biāo)為大鼠進(jìn)入開(kāi)臂次數(shù)與入臂總次數(shù)百分比(OE%)、在開(kāi)臂內(nèi)停留時(shí)間與入臂總時(shí)間百分比(OT%)。每只大鼠測(cè)試結(jié)束以75%酒精擦拭高架，清除糞便，再進(jìn)行下一只大鼠的測(cè)試。

2.3 大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物含量測(cè)定

2.3.1 蛋白沉淀劑的配置

配置含0.5 mmol亞硫酸鈉、0.3 mmol乙二胺四乙酸二鈉，濃度為0.1 mol/L高氯酸溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置

分別精密稱量五羥色胺(5-HT)、五羥吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺(DA)、二羥苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)標(biāo)準(zhǔn)品適量，加0.1 mol/L高氯酸溶液配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，-30℃條件下保存，臨用前再定量混合，配置成濃度為102 ppm DOPAC，98 ppm DA，101 ppm 5-HIAA，89 ppm HVA，101 ppm 5-HT混合溶液，并以體積為0.5 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、12 μL進(jìn)樣。

2.3.3 樣品處理

大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即斷頭并迅速在冰盤上剝離海馬組織，用冰冷的生理鹽水洗凈，濾紙拭干，-80℃保存。分析時(shí)稱重后放入玻璃勻漿器中，加入預(yù)冷的蛋白沉淀劑勻漿，離心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)2次，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，采用HPLC-ECD分析。

2.3.4 色譜條件

色譜柱：Atlantis C18柱(2.1mm×150 mm,3 μm)，流動(dòng)相：A為50 mM檸檬酸-乙酸鈉(pH值3.5，內(nèi)含1.8 mM二正丁胺、1 mM B8離子對(duì)試劑、0.3 mM乙二胺四乙酸二鈉)，流動(dòng)相B為甲醇。96%A-4%B等度洗脫；流速為0.35 mL/min，進(jìn)樣量10 μl,檢測(cè)電壓為+ 0.75 V,結(jié)果以濕組織濃度計(jì)(μg/g)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 LRE對(duì)大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)影響

與空白組相比，黑果枸杞提取物中劑量組可增加大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)(P<0.05)，具有顯著性差異，地西泮組、黑果枸杞提取物高劑量組大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)顯著增加(P<0.01)；上述3組大鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)停留時(shí)間均增加(P<0.05)，具有顯著性差異；與空白組相比，地西泮組、中藥組對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)總路程無(wú)顯著差異，說(shuō)明地西泮和黑果枸杞提取物對(duì)大鼠自主活動(dòng)無(wú)影響。具體見(jiàn)表1，圖1。

表1 LRE對(duì)大鼠OFT的影響

注：與空白組相比，*P<0.05,**P<0.01

3.2 LRE對(duì)大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

與空白組相比，地西泮組、黑果枸杞提取物中、高劑量組可增加大鼠進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)百分比和在開(kāi)臂活動(dòng)時(shí)間百分比，具有顯著性差異(P<0.05)，其中地西泮組可顯著增加大鼠再開(kāi)臂活動(dòng)時(shí)間百分比(P<0.01)，具體見(jiàn)表2，圖2。

表2 LRE對(duì)大鼠EPM的影響

注：與空白組相比，*P<0.05,**P<0.01

圖2 LRE對(duì)大鼠EPM的影響

3.3 LRE對(duì)大鼠海馬單胺類遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的影響

與空白組相比，地西泮組、黑果枸杞提取物高劑量組大鼠海馬5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA含量降低，具有顯著性差異(P<0.05);而黑果枸杞提取物組大鼠海馬DA及其代謝產(chǎn)物HVA、DOPAC含量無(wú)顯著變化，具體見(jiàn)表3。表明LRE抗焦慮作用機(jī)制可能與其對(duì)焦慮后的5-HT能系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

表3 LRE對(duì)EPM大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的影響

注：與空白組比較，**P<0.01，*P<0.05

4 討論

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是由Hall等于1934年發(fā)明，其原理是利用大鼠因畏懼空曠場(chǎng)地的天性而產(chǎn)生驅(qū)避性活動(dòng)[14]。通常以大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)和停留時(shí)間為評(píng)價(jià)焦慮癥的行為學(xué)指標(biāo)。因其設(shè)備簡(jiǎn)單、操作便捷，被作為評(píng)價(jià)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)廣泛使用。本實(shí)驗(yàn)中黑果枸杞提取物中、高劑量組可顯著增加大鼠進(jìn)入曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)的次數(shù)，增加其停留時(shí)間，表現(xiàn)出明顯的抗焦慮作用，且不影響大鼠的自主活動(dòng)。高架十字迷宮具有簡(jiǎn)便快速敏感性好等優(yōu)點(diǎn)，為抗焦慮研究中國(guó)際公認(rèn)的應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典焦慮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[15-16]，因動(dòng)物對(duì)高架新異環(huán)境有探究特性的同時(shí)又對(duì)其高懸敞開(kāi)臂有恐懼心理，會(huì)形成心理上的矛盾沖突，從而可以考察其焦慮狀態(tài)，動(dòng)物進(jìn)入開(kāi)放臂次數(shù)比和開(kāi)放臂停留時(shí)間比是該測(cè)試中的經(jīng)典指標(biāo)[17]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到黑果枸杞提取物的中、高劑量組大鼠進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)百分比和在開(kāi)臂活動(dòng)時(shí)間百分比均提高，有明顯的抗焦慮作用。

5-HT、DA均是與焦慮相關(guān)的主要單胺類神經(jīng)遞質(zhì),在海馬、大腦皮質(zhì)等邊緣結(jié)構(gòu)中含量的異常升高均會(huì)引發(fā)焦慮情緒[18-20]。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同種屬大鼠的海馬中5-HT含量與其焦慮程度呈正相關(guān)[21]。而研究表明，具有降低5-HT功能作用的藥物能起到抗焦慮作用[22]，如經(jīng)典抗焦慮藥物地西泮[23-24]。多巴胺系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)焦慮[25]，在功能上，該系統(tǒng)主要與情緒及本能活動(dòng)有關(guān)[26]。本實(shí)驗(yàn)觀察到，地西泮、黑果枸杞提取物中、高劑量組均能顯著降低大鼠海馬中5-HT的含量；地西泮使大鼠海馬中DA及其代謝產(chǎn)物含量降低，而黑果枸杞提取物中、高劑量組對(duì)大鼠海馬中DA含量?jī)H顯示出不同程度的降低作用趨勢(shì)，提示地西泮和黑果枸杞提取物抗焦慮作用主要與其對(duì)海馬中5-HT含量的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，同時(shí)，從二者對(duì)5-HT的代謝產(chǎn)物5-HIAA含量亦有顯著降低作用來(lái)看，推測(cè)地西泮和黑果枸杞提取物可能是通過(guò)抑制海馬中5-HT合成與釋放起抗焦慮作用。提示黑果枸杞提取物與陽(yáng)性藥物地西泮對(duì)大鼠海馬中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用可能有所不同。

自然界植物中較為常見(jiàn)的花色苷為矢車菊素衍生物，黑果枸杞花色苷中不含此類成分，主要是錦葵素、矮牽牛素、飛燕草素等的衍生物[2,27-29]，因此，關(guān)于黑果枸杞花色苷與其他花色苷類成分抗焦慮作用的比較及其抗焦慮作用的構(gòu)效關(guān)系值得進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究首次探索了黑果枸杞對(duì)焦慮的作用，結(jié)果表明LRE在大鼠OFT和EPM實(shí)驗(yàn)中具有明確的抗焦慮作用，可能與調(diào)節(jié)5-HT能系統(tǒng)有關(guān)。這一研究結(jié)果為發(fā)掘傳統(tǒng)藏藥黑果枸杞的潛在藥用價(jià)值，研發(fā)安全、有效的天然抗焦慮藥物開(kāi)辟了新的思路，對(duì)珍貴民族藥資源的合理開(kāi)發(fā)利用深有裨益。

[1] 帝瑪爾·丹增彭措.晶珠本草[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2012.

[2] 譚亮,董琦,曹靜亞,等.黑果枸杞中花色苷的提取與結(jié)構(gòu)鑒定[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2014(11):1797-1802.

[3] 張小敏,冉林武,曹有龍,等.黑果枸杞花色苷HPLC半定量分析[J].食品工業(yè),2014(11):207-209.

[4] 陳晨,文懷秀,羅智敏,等.白刺色素和黑果枸杞色素中花色苷與總多酚的測(cè)定[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2010(5):1796-1798.

[5] 李進(jìn),瞿偉菁,張素軍,等.黑果枸杞色素的抗氧化活性研究[J].中國(guó)中藥雜志,2006,31(14):1179-1183.

[6] ZHENG J,DING C,WANG L,et al. Anthocyanins composition and antioxidant activity of wild Lycium ruthenicum Murr. from Qinghai-Tibet Plateau[J].Food Chem, 2011,126(3): 859-865.

[7] 閆亞美,代彥滿,冉林武,等.黑果枸杞與5種果蔬中花色苷組成及體外抗氧化活性比較[J].食品工業(yè)科技,2014(16):133-136.

[8] WUT, LV H, WANG F, et al.Characterization of Polyphenols from Lycium ruthenicum Fruit by UPLC-Q-TOF/MSE and Their Antioxidant Activity in Caco-2 Cells[J].J Agr Food Chem,2016,64(11):2280-2288.

[9] BADSHAH H, KIM T H, KIM M O. Protective effects of Anthocyanins against Amyloid beta-induced neurotoxicity in vivo and in vitro[J]. Neuro chem Int,2015(80):51-59.

[10] GUTIERRES J M, CARVALHO F B, SCHETINGER M R C, et al. Neuroprotective effect of anthocyanins on acetylcholinesterase activity and attenuation of scopolamine-induced amnesia in rats[J].Int J dev Neurosci, 2014, 33: 88-97.

[11] VYAS P, KALIDINDI S, CHIBRIKOVA L, et al. Chemical Analysis and Effect of Blueberry and Lingonberry Fruits and Leaves against Glutamate-Mediated Excitotoxicity[J].J Agr Food Chem,2013,61(32):7769-7776.

[12] RENDEIRO C, VAUZOUR D, RATTRAY M, et al. Dietary Levels of Pure Flavonoids Improve Spatial Memory Performance and Increase Hippocampal Brain-Derived Neurotrophic Factor[J].Plos One, 2013,8(e63535).

[13] DREISEITEL A, KORTE G, SCHREIER P, et al. Berry anthocyanins and their aglycons inhibit monoamine oxidases A and B[J]. Pharmacol R,2009,59(5):306-311.

[14] PRUT L, BELZUNG C. The open field as a paradigm to measure the effects of drugs on anxiety-like behaviors: a review[J].Eur J of Pharmacol,2003,463(1-3):3-33.

[15] DALVI A,RODGERS R J.Behavioral effects of diazepam in the murine plus-maze: flumazenil antagonism of enhanced head dipping but not the disinhibition of open-armavoidance[J].Pharmacol Biochem Behav,1999,62(4):727-734．

[16] MORAESCL,BERTOGLIOL J,CAROBREZ A P. Interplay between glutamate and serotonin within the dorsal periaqueductal gray modulates anxiety-related behavior of rats exposed to the elevated plus-maze[J].Behav Brain Res, 2008,194(2):181-186．

[17] BARBALHO C A,NUNES de SOUZA R L,CANTO de SOUZA A．Similar anxiolytic-like effects following intra-amygdala infusions of benzodiazepine receptor agonist and antagonist: evidence for the release of an endogenous benzodiazepine inverse agonist in mice exposed to elevated plus-mazetest[J].Brain Res,2009,1267(24):65-76．

[18] 周奇志,趙紀(jì)嵐,蔡定均,等.電針對(duì)慢性情緒應(yīng)激焦慮大鼠中樞單胺遞質(zhì)與-氨基丁酸失平衡的調(diào)節(jié)作用[J].中華中醫(yī)藥雜志,2008,23(10):926-929．

[19] 李杰.抑郁癥患者心理彈性、社會(huì)支持與生活質(zhì)量相關(guān)性研究[J].精神醫(yī)學(xué)雜志,2016,29(4):259-262.

[20] 劉娟,馬建偉.糖尿病合并抑郁、焦慮癥的中西醫(yī)研究現(xiàn)狀[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2015,27(9):47-52.

[21] WEDZONY K,MACKOWIAK M,FIJAL K,et al.Evidence that conditioned stress enhances outflow of dopamine in rat prefrontal cortex: a search for the influence of diazepam and 5-HT1 Aagonists[J].Synapse,1996,24(3):240-247.

[22] SILVARC,BRANDAOML.A cuteand chronic effects of Gepirone and fluoxetine in rats tested in the elevated plus maze: an ethological analysis[J].Pharmacol Biochem Behav,2000,65(2):209-216.

[23] BRODERICK PA. Alprazolam, diazepam,yohimbine, clonidine: in vivo CA1 hippocampal norepinephrine and serotonin release profiles under chloral hydrate anesthesia[J].Prog Neuropsy chopharmacol Biol Psychiatry, 1997,21(7):1117-1140．

[24] FILESE,PELLOWS. No cross-tolerance between the stimulatory and depressant actions of benzodiazepines inmice[J].Behav Brain Res,1985,17(1):1-7．

[25] NAVARRO J F, LUNA G, GARCIA F,et al. Effects of L-741,741,a selective dopamine receptor antagonist,on anxiety tested in the elevated plus-mazein mice[J].Methods Find Exp Clin Pharmacol,2003,25(1):45-47．

[26] BONACCORSO S, PUZELLA A, MARINO V, et al. Immunotherapy with interferon-alpha inpatients affected bychronic hepatitis C induces an intercorrelated stimulation of the cytokine network and an increase in depressive and anxiety symptoms[J].Psychiatry Res,2001,105(1-2):45-55．

[27] 歐陽(yáng)發(fā),吉騰飛,蘇亞倫,等.黑果枸杞果實(shí)化學(xué)成分研究[J].中藥材,2012,35(10):1599-1601.

[28] ZHENG J,DING C,WANG L,et al.Anthocyanins composition and antioxidant activity of wild LyciumruthenicumMurr. from Qinghai-Tibet Plateau[J].Food Chem,2011,126(3):859-865.

[29] JIN H,LIU Y,YANG F, et al. Characterization of anthocyanins in wild Lycium ruthenicum Murray by HPLC-DAD/QTOF-MS/MS[J].Anal. Methods,2015,7(12):4947-4956.