廣靈苦蕎黃酮類(lèi)化合物的分離和鑒定

，，， ，，

(1.山西大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所，山西 大同 037009；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒作物研究所，山西 大同 037008)

苦蕎(FagopyrumtatariumGaertn)屬于蓼科蕎麥屬栽培作物，也稱為韃靼蕎麥，含有豐富的生物類(lèi)黃酮物質(zhì)，具有降低血糖、血脂和抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，能夠有效的降低毛細(xì)血管的脆性、有效預(yù)防腦出血，同時(shí)還具有改善視力的功效[1-4]。臨床上主要用于治療糖尿病、高血糖、高血脂和高血壓等。具有很高的藥用價(jià)值，可以作為功能性食品或藥品的原料，在食品和醫(yī)藥工業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。

苦蕎麥在我國(guó)分布十分廣泛，山西北部地區(qū)是苦蕎麥的主產(chǎn)區(qū)。不同產(chǎn)地苦蕎總黃酮含量表現(xiàn)出一定的差異性。本課題組初步對(duì)山西廣靈苦蕎的研究表明，產(chǎn)于山西的苦蕎麥中總黃酮含量顯著高于湖南、寧夏、貴州、云南等地的苦蕎麥。為進(jìn)一步了解山西特有苦蕎品種的黃酮類(lèi)物質(zhì)，本試驗(yàn)首次以山西北部地區(qū)種植的苦蕎品種廣靈苦蕎2號(hào)為研究對(duì)象，分離和鑒定了其所含的黃酮類(lèi)物質(zhì)。廣靈苦蕎2號(hào)主要種植于山西省大同市廣靈縣及靈丘縣等地，前期化學(xué)成分預(yù)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該品種總黃酮含量較高，因而進(jìn)一步對(duì)廣靈苦蕎的黃酮類(lèi)成分進(jìn)行了分離純化，本研究報(bào)道了從廣靈苦蕎中分離得到7種黃酮類(lèi)化合物及其結(jié)構(gòu)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物材料：廣靈苦蕎2號(hào)種子(由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒作物研究所提供)。

藥品和試劑：柱層析用大孔吸附樹(shù)脂柱(AB-8，天津波鴻樹(shù)脂科技有限公司)，硅膠(青島海洋化工股份有限公司)，Sephadex LH-20(上海安瑪西亞股份有限公司)，HPLC用色譜純?cè)噭?上海星可生化有限公司)，其余為分析純?cè)噭?/p>

儀器：核磁共振儀Bruker ADVANCE 400 MHz(德國(guó)布魯克公司，TMS作為內(nèi)標(biāo))，熔點(diǎn)儀Fisher-Johns(北京市科儀電光儀器廠)，高效液相色譜Agilent 1200型(美國(guó)安捷倫公司)。Welch material XB-C 18柱(4.6 mm×250 mm，5μm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮類(lèi)化合物的提取

蕎麥種子去除雜質(zhì)后，研磨，過(guò)60目篩，于105 ℃烘箱中烘至恒重。取苦蕎種子粉末2 kg，利用超聲波輔助提取苦蕎中總黃酮，提取條件為60%的乙醇溶液，料液比為1∶10，抽提溫度為70 ℃，提取1 h，反復(fù)提取2次，得到苦蕎黃酮提取液。將黃酮提取液減壓濃縮，陰干后得到粗提取物(73.6 g)。

1.2.2 黃酮類(lèi)化合物的分離純化

粗提取物經(jīng)AB-8型大孔吸附樹(shù)脂為填料的層析柱，用20%～70%的乙醇溶液以0.5 mL/min的速度梯度洗脫，收集70%乙醇溶液的洗脫液，得到化合物1(2.65 g)，其余洗脫液合并。合并后的洗脫液經(jīng)硅膠柱層析以氯仿和甲醇梯度洗脫(體積比分別為100∶1，50∶1，20∶1，10∶1)得到4個(gè)部分Fr.A-D。Fr.A經(jīng)硅膠層析柱以石油醚和乙酸乙酯1∶9洗脫后再經(jīng)凝膠柱Sephadex LH-20以氯仿和甲醇1∶1純化得到化合物2(20 mg)。Fr.B經(jīng)反復(fù)硅膠層析柱純化收集到化合物3(16 mg)和化合物4(18 mg)。Fr.C經(jīng)HPLC分離，以乙腈-水為流動(dòng)相(1∶5；流速2 mL/min)，得到化合物5(310 mg)和化合物6(23 mg)。Fr.D經(jīng)HPLC，以甲醇-水為流動(dòng)相(4∶1；流速2.5 mL/min)，分離得到化合物7(15 mg)。

圖1 廣靈苦蕎中的黃酮化合物

1.2.3 黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

將沉淀物溶于甲醇，在離子源為ESI源條件下進(jìn)行MS鑒定；將沉淀物溶于三氯甲烷氘代試劑，在400 MHz條件下進(jìn)行核磁共振法對(duì)所得化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2 結(jié)果與分析

廣靈苦蕎中分離到7個(gè)黃酮化合物，通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道的的數(shù)據(jù)比較，被鑒定為蘆丁、表兒茶素、異槲皮素、槲皮素-3-O-鼠李糖苷，槲皮素、山奈酚、金絲桃苷(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)。

化合物1：黃色粉末，C27H30O16,ESI-MSm/z：611.2 [M+H]+,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.19(1 H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.38(1 H,d,J=2.0 Hz,H-8),7.53(1 H,d,J=2.1 Hz,H-2′),6.84(1 H,d,J=8.0 Hz,H-5′),7.55(1 H,dd,J=2.1 Hz,8.0 Hz,H-6′),5.35(1 H,d,J=7.2 Hz,H-1′′),4.39(1 H,s,H-11′′′),2.6(1 H,s,5-OH),10.7(1 H,s,7-OH),9.34(1 H,s,4′-OH),1.00(3 H,d,J=6.2 Hz,6′′′-CH3).13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶157.0(C-2),133.8(C-3),177.8(C-4),161.7(C-5),99.2(C-6),164.6(C-7),94.0(C-8),156.9(C-9),104.4(C-10),122.0(C-1′),115.7(C-2′),145.2(C-3′),148.9(C-4′),116.7(C-5′),121.6(C-6′),101.7(C-1′′),74.5(C-2′′),76.9(C-3′′),71.0(C-4′′),76.4(C-5′′),67.4(C-6′′),101.2(C-1′′′),70.8(C-2′′′),70.5(C-3′′′),72.3(C-4′′′),68.7(C-5′′′),18.2(C-6′′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，經(jīng)鑒定該化合物為蘆丁。

化合物2：黃色粉末，C15H14O6,ESI-MSm/z：291.1[M+H]+,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.87(1 H,s,H-2′),6.65(1 H,d,J=7.8 Hz,H-6′),6.63(1 H,d,J=7.8 Hz,H-5′),5.88(1 H,d,J=2.4 Hz,H-8),5.70(1 H,d,J=2.4 Hz,H-6),4.72(1 H,s,H-2),3.99(1 H,m,H-3),2.67(1 H,dd,J=16.2 Hz,4.2 Hz,H-4 a),2.47(1 H,dd,J=18.6,4.2 Hz,H-4 b).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶156.5(C-9),156.2(C-7),155.7(C-5),144.8(C-3′),144.5(C-4′),130.5(C-1′),117.9(C-6′),114.9(C-5′),114.7(C-2′),98.4(C-10),95.0(C-6),94.0(C-8),78.2(C-2),64.9(C-3),28.2(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，經(jīng)鑒定該化合物為表兒茶素。

化合物3：黃色針狀結(jié)晶，C21H20O12,ESI-MSm/z：465.1[M+H]+,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.41(1 H,d,J=1.8 Hz,8-H),6.20(1 H,d,J=1.8 Hz,6-H),7.57(1 H,d,J=2.0Hz,2′-H),7.58(1 H,dd,J=2.0,8.5 Hz,6′-H),6.83(1 H,d,J=8.5 Hz,5′-H),5.46(1 H,d,J=7.2 Hz,H-1′′).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶156.7(C-2),133.9(C-3),177.9(C-4),161.7(C-5),99.2(C-6),164.6(C-7),94.0(C-8),156.8(C-9),104.5(C-10),121.7(C-1′),115.7(C-2′),145.3(C-3′),148.9(C-4′),116.7(C-5′),122.1(C-6′),101.5(C-1′′),74.6(C-2′′),77.0(C-3′′),70.5(C-4′′),78.0(C-5′′),61.5(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]、[8]報(bào)道一致，經(jīng)鑒定該化合物為異槲皮素。

化合物4：黃色針狀結(jié)晶，C21H20O11,ESI-MSm/z：449.1[M+H]+,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.21(1 H,d,J=1.8 Hz,H-6),6.39(1 H,d,J=1.8 Hz,H-8),7.31(1 H,d,J=2.1Hz,H-2′),6.86(1 H,d,J=8.7 Hz,H-5′),7.26(1 H,dd,J=2.1,8.7 Hz,H-6′),5.26(1 H,d,J=1.3 Hz,H-1′′),12.7(1 H,s,5-OH),10.8(1 H,s,7-OH),9.44(1 H,s,4′-OH),0.82(3 H,d,J=6.0 Hz,6′′-CH 3).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶156.9(C-2),134.7(C-3),178.2(C-4),161.8(C-5),99.2(C-6),164.7(C-7),94.1(C-8),157.8(C-9),104.5(C-10),121.6(C-1′),115.9(C-2′),145.7(C-3′),148.9(C-4′),116.1(C-5′),121.2(C-6′),102.3(C-1′′),70.8(C-2′′),71.0(C-3′′),71.6(C-4′′),70.5(C-5′′),18.0(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]，經(jīng)鑒定該化合物為槲皮素-3-O-鼠李糖苷。

化合物5：黃色粉末，C15H10O7,ESI-MSm/z：303.0[M+H]+,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.19(1 H,d,J=1.8 Hz,6-H),6.41(1 H,d,J=1.8 Hz,8-H),6.88(1 H,d,J=8.4 Hz,5′-H),7.54(1 H,dd,J=2.0,8.4 Hz,6′-H),7.68(1 H,d,J=2.0 Hz,2′-H),9.34(1 H,s,3′-OH),9.40(1 H,s,4′-OH),9.62(1 H,s,3-OH),10.80(1 H,s,7-OH),12.51(1 H,s,5-OH).13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶147.2(C-2),136.2(C-3),176.3(C-4),161.2(C-5),98.6(C-6),164.3(C-7),93.8(C-8),156.6(C-9),103.5(C-10),122.4(C-1′),115.5(C-2′),145.5(C-3′),148.2(C-4′),116.1(C-5′),120.4(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道一致，經(jīng)鑒定該化合物為槲皮素。

化合物6：黃色針狀結(jié)晶，C5H10O6,ESI-MSm/z：287.1[M+H]+,1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶6.17(1 H,d,J=2.0 Hz,6-H),6.44(1 H,d,J=2.0 Hz,8-H),6.93(2 H,d,J=8.7 Hz,3′,5′-H),8.05(2 H,d,J=8.7 Hz,2′,6′-H),12.49(1 H,s,5-OH),10.81(1 H,s,7-OH),9.44(1 H,s,3′-OH),10.13(1 H,s,4′-OH),13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶146.9(2-C),135.8(3-C),176.0(4-C),156.3(5-C),98.3(6-C),164.0(7-C),93.6(8-C),160.8(9-C),103.1(10-C),121.8(1′-C),129.6(2′-C),115.5(3′-C),159.3(4′-C),115.5(5′-C),129.6(6′-C),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，經(jīng)鑒定該化合物為山奈酚。

化合物7：黃色針狀結(jié)晶，C21H20O11,ESI-MSm/z：465.1[M+H]+,1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)∶δ∶12.64(1 H,s,5-OH),10.96(1 H,s,7-OH),9.81(1 H,s,3′-OH),9.26(1 H,s,4′-OH),7.66(1 H,dd,J=4.0 Hz,8.0 Hz,6′-H),7.54(1 H,d,J=4.0 Hz,2′-H),6.82(1 H,d,J=8.0 Hz,5′-H),6.41(1 H,d,J=4.0 Hz,8-H),6.20(1 H,d,J=4.0 Hz,6-H),5.38(1 H,d,J=8.0 Hz,1′′-H).13CNMR(100 MHz,DMSO-d6)∶δ∶177.93(C-4),164.58(C-7),161.66(C-5),156.74(C-2),148.92(C-4′),145.27(C-3′),133.91(C-3),122.42(C-6′),121.52(C-1′),116.39(C-5′),115.63(C-2′),104.36(C-10),102.23(C-1′′),99.12(C-6),93.97(C-8),76.27(C-5′′),73.34(C-3′′),71.64(C-2′′),68.36(C-4′′),60.57(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致，經(jīng)鑒定該化合物為槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷(金絲桃苷)。

3 結(jié) 論

本研究首次對(duì)苦蕎麥品種“廣靈苦蕎2號(hào)”籽粒的黃酮化合物進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定，其中化合物2-5和7為首次從廣靈苦蕎中分離。由已鑒定出的化合物來(lái)看，該品種苦蕎麥籽粒含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)，可以作為黃酮類(lèi)化合物的新來(lái)源。其結(jié)果為苦蕎麥的深加工提供了有益參考，也為當(dāng)?shù)卮笠?guī)模綜合開(kāi)發(fā)利用該資源提供了理論依據(jù)。但本研究?jī)H對(duì)廣靈苦蕎的黃酮類(lèi)化合物的類(lèi)別進(jìn)行了初步探討，需要進(jìn)一步對(duì)其提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，隨著新的提取分離技術(shù)的應(yīng)用，可能會(huì)有更多的黃酮類(lèi)成分會(huì)從廣靈苦蕎發(fā)現(xiàn)，而對(duì)于已分離的黃酮類(lèi)成分的提取量也會(huì)進(jìn)一步提高。同時(shí)在分離工藝的優(yōu)化中，應(yīng)充分考慮質(zhì)量與數(shù)量的統(tǒng)一，對(duì)具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值的成分設(shè)計(jì)出更加簡(jiǎn)便有效的工藝，進(jìn)一步提高提取率和產(chǎn)品收益率。

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