晉藜1號種子及幼苗對疊氮化鈉誘變的響應(yīng)

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(1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西 忻州 034000)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld)是藜科雙子葉植物，營養(yǎng)價值高，蛋白質(zhì)含量高達16%～22%，是稻米的2～3倍，易被人體吸收，受到國內(nèi)外營養(yǎng)學(xué)家和農(nóng)學(xué)家的重視[1-3]。研究表明，長時間食用藜麥，對心臟病、高血壓、高血糖等疾病有很好的治療效果，此外藜麥還有增強機體免疫力、補充營養(yǎng)及減肥等功效[4]。因藜麥在營養(yǎng)價值和營養(yǎng)安全等方面的突出作用，聯(lián)合國大會宣布2013年為“國際藜麥年”[5]。21 世紀以來，隨著發(fā)達國家藜麥主食化和多樣化的發(fā)展，藜麥的國際市場需求日益強烈，極大地促進了藜麥的生產(chǎn)加工[2]。目前，藜麥在我國陜西西安、山西、青海、四川等地區(qū)多有種植[5]，由于我國藜麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷史較短，藜麥生產(chǎn)加工企業(yè)數(shù)量不多，缺乏專業(yè)的生產(chǎn)加工設(shè)備和技術(shù)，加工產(chǎn)品種類少，加之，藜麥的種植技術(shù)還不成熟、產(chǎn)量低、質(zhì)量差，所以提高黎麥質(zhì)量、產(chǎn)量與品種的抗逆性，是我國農(nóng)業(yè)育種研究的主要課題之一[6]。

疊氮化鈉(NaN3)作為一種化學(xué)誘變劑，具有效率高、無毒、價格便宜及使用安全等特點[7]。在pH=3的溶液中產(chǎn)生HN3分子，表現(xiàn)為中性，由于細胞膜不能將其截留，能透過細胞膜進入到細胞質(zhì)中，從而通過堿基替換的方式影響DNA的正常合成，導(dǎo)致了點突變的產(chǎn)生[8-10]。

目前有關(guān)疊氮化鈉在作物誘變方面研究實例較多。曹欣等指出，不同種類的大麥在疊氮化鈉的誘變作用下，結(jié)果有明顯的差異，初步闡述了疊氮化鈉誘變育種的機理，為育種工作提供了理論依據(jù)[11]。M.Afsar Awan等研究結(jié)果表明，在水稻遺傳學(xué)和育種誘變中，疊氮化鈉不僅是誘發(fā)葉綠體缺失的強誘變劑，而且能有效誘發(fā)出水稻利于存活的生理和形態(tài)突變體[12]。李明飛等對小麥進行了疊氮化鈉誘變，結(jié)果表明，普通小麥在10 mmol/L的疊氮化鈉的誘變作用下，可產(chǎn)生良好的誘變效果，并且通過M2代性狀的田間鑒定，取得58個可遺傳突變體系[13]。但這些研究大多集中于構(gòu)建M1代、M2代突變體庫，針對在苗期，疊氮化鈉誘變對藜麥幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響以及抗逆性的研究鮮有報道。

本實驗以適宜山西靜樂種植，生物性狀比較優(yōu)異的晉藜1號種子為材料，通過疊氮化鈉誘變，探尋時間與濃度的適宜誘變組合，以及晉藜1號幼苗抗氧化系統(tǒng)對疊氮化鈉誘變的響應(yīng)，為藜麥種質(zhì)創(chuàng)新和突變體庫的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

實驗材料為大小均勻、顆粒飽滿的晉藜1號種子(由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所提供)。

1.1.2 化學(xué)誘變劑

疊氮化鈉(NaN3)購買自天津市登峰化學(xué)試劑廠，誘變液為含有疊氮化鈉的磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH=3)。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理

用10%次氯酸鈉處理晉藜1號種子10 min后，以清水浸泡1 h，然后將其表面水分瀝干，待用。實驗設(shè)置4個誘變時間：0，2.5，5，7.5 h，6個誘變濃度：0，5，10，15，20，25 mmol/L，每組3次重復(fù)。按要求進行誘變，每個燒杯中放入150粒晉藜1號種子，加入15 mL各濃度的疊氮化鈉，放入全溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(設(shè)25 ℃，188 r/h)到規(guī)定時間取出。用硫代硫酸鈉(0.1 mol/L)溶液終止反應(yīng)，并清洗3～5遍，之后用無菌水沖洗3遍，瀝干種子，轉(zhuǎn)入玻璃培養(yǎng)皿中，在每個培養(yǎng)皿中加入等量的無菌水，以將濾紙潤濕不會有多余的浸出為標準，然后用鑷子將種子均勻擺放，防止種子粘連在一起影響種子萌發(fā)，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(設(shè)為25 ℃)，每天加入一定量的蒸餾水，記錄每天的發(fā)芽率[14]，發(fā)芽率(%)=每天發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%。

1.2.2 砂土混合培養(yǎng)

將發(fā)芽后的種子移入花盆中，砂和土的比例為1∶1，待植株長出后進入4葉期，對相關(guān)生理指標進行測定。

1.3 指標測定

MDA含量、SOD活性、CAT活性及脯氨酸含量測定方法參考高俊鳳版《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22對數(shù)據(jù)進行分析。對不同處理的發(fā)芽率、相對發(fā)芽率、SOD、CAT、MDA、脯氨酸等指標的變化做單因素方差分析。采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時間、不同濃度疊氮化鈉處理對晉藜1號種子發(fā)芽率的影響

由表1可知：在相同誘變時間內(nèi)，隨著誘變劑濃度的增加，種子發(fā)芽率呈降低趨勢，說明種子萌發(fā)受到抑制；在同一誘變濃度下，誘變時間的增加也會導(dǎo)致發(fā)芽率的降低，說明誘變時間越長，晉藜1號種子受損壞越嚴重。原因可能是疊氮化鈉的誘變使植物細胞中產(chǎn)生點突變，合成氨基酸類似物，干擾機體正常功能導(dǎo)致種子發(fā)芽率降低[7]。由數(shù)據(jù)可知：用10 mmol/L的誘變劑對黎麥種子處理7.5 h，發(fā)芽率為53%，接近半致死率。

2.2 不同時間、不同濃度疊氮化鈉處理對晉藜1號幼苗中MDA含量的影響

由圖1可知：同一處理時間，隨著疊氮化鈉處理濃度的增加，晉藜1號幼苗中MDA含量均呈升高的趨勢。當處理時間為2.5 h時，誘變濃度低于10 mmol/L的疊氮化鈉對MDA的含量影響無顯著差異。誘變時間為5，7.5 h時，各處理濃度對MDA含量都有顯著性差異。同一處理濃度時，誘變時間的延長，幼苗中MDA含量也會有所升高，且長時間誘變與短時間誘變相比幼苗MDA含量變化增幅較大。

表1 用疊氮化鈉誘變劑處理后的晉藜1號種子第7天的發(fā)芽率、相對發(fā)芽率

圖1 在5，10，15，20，25 mmol/L疊氮化鈉濃度下處理2.5，5，7.5 h時MDA含量變化(p=0.05)

2.3 不同時間、不同疊氮化鈉濃度處理對晉藜1號幼苗葉片SOD活性的影響

由圖2可知：相同誘變時間，不同濃度的疊氮化鈉對晉藜1號葉片SOD活性相對于對照均有顯著的提高。誘變時間為2.5 h時，SOD活性隨著誘變濃度的增加而升高。當誘變時間為5，7.5 h時，SOD活性呈先升高后降低的趨勢。從圖2可以看出，隨著誘變時間的延長，葉片SOD活性的最大值會向低濃度偏移。在相同誘變濃度下，誘變時間越長，SOD活性越高。

圖2 在5，10，15，20，25 mmol/L疊氮化鈉濃度下處理2.5，5，7.5 h時SOD活性變化(p=0.05)

2.4 不同時間、不同疊氮化鈉濃度處理對晉藜1號幼苗葉片CAT活性的影響

如圖3，相同誘變時間，疊氮化鈉誘變濃度越大，晉藜1號葉片中CAT活性越高。有所不同的是，誘變時間為2.5 h時，葉片CAT活性升高與誘變濃度增加呈線性關(guān)系。當誘變時間為5 h時，CAT活性的增幅隨疊氮化鈉濃度的增加而降低。誘變時間為7.5 h時，CAT活性的增幅則隨疊氮化鈉濃度的增加而升高。同一疊氮化鈉濃度，誘變時間越長，葉片CAT活性越高。

圖3 在5，10，15，20，25 mmol/L疊氮化鈉濃度下處理2.5，5，7.5 h時CAT活性變化(p=0.05)

2.5 不同時間、不同疊氮化鈉濃度處理后，晉藜1號幼苗葉片脯氨酸含量的變化

由圖4可知：在相同誘變時間，誘變濃度的升高導(dǎo)致脯氨酸的含量上升；在同一處理濃度下，誘變時間的增加也導(dǎo)致脯氨酸的含量增加；當誘變時間為5 h時，處理濃度低于10 mmol/L時，脯氨酸增長趨勢較為平緩，當處理時間高于5 h，處理濃度大于10 mmol/L時，脯氨酸含量急劇升高。不同時間及不同濃度的疊氮化鈉對晉藜1號葉片脯氨酸含量的影響總體趨勢與對MDA含量影響相同。說明疊氮化鈉誘變劑干擾晉藜1號內(nèi)部代謝較為嚴重。由疊氮化鈉誘變機理可知：NH3分子進入植物細胞，造成植物細胞氨中毒，而脯氨酸含量相對增加在一定程度上可以緩解氨中毒。所以在處理時間較短，誘變濃度較低時脯氨酸的含量增加較緩慢，誘變時間越大，濃度越大，脯氨酸增長的幅度也越大。

圖4 在5，10，15，20，25 mmol/L疊氮化鈉濃度下處理2.5，5，7.5 h時脯氨酸含量的變化(p=0.05)

3 討論與結(jié)論

疊氮化鈉對種子發(fā)芽及幼苗生長的影響與逆境環(huán)境對種子的影響相似，抗氧化酶活性的變化與幼苗在逆境條件下的應(yīng)對反應(yīng)也相一致。植物器官在受逆境脅迫時機體內(nèi)自由基含量會增加，致使細胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生氧化，其中MDA為脂肪酸氧化分解的主要產(chǎn)物，MDA能與膜中蛋白質(zhì)和酶發(fā)生聚合作用，產(chǎn)生不溶物，并不斷沉積，從而對機體造成損傷[15]。植物在正常生長情況下，可以清除體內(nèi)自由基，而經(jīng)疊氮化鈉處理后，機體內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生較多且不斷累積，抗氧化系統(tǒng)無法將其全部清除，導(dǎo)致機體受到損傷?？寡趸到y(tǒng)包括抗氧化劑如脯氨酸等，以及抗氧化酶類如CAT和SOD等。經(jīng)短時間、低濃度疊氮化鈉誘變處理，植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)受到刺激，大量酶和相關(guān)物質(zhì)被合成，清除自由基，避免機體損傷，表現(xiàn)為SOD、CAT酶活性均升高[16]。隨著疊氮化鈉濃度的增加、浸種時間的延長，抗氧化系統(tǒng)的功能受到損傷，多種酶之間活性比不平衡[17]，人們通過在實驗?zāi)M現(xiàn)實存在的各種逆境，測定植物體內(nèi)的保護酶活性變化，來確定植物對該逆境脅迫的承受上限和耐受范圍，同時這些酶活性的變化也可以作為植物抗逆性強弱的指標。

本實驗以晉藜1號種子為材料，通過疊氮化鈉誘變，探尋時間和濃度的適宜誘變組合，以及晉藜1號幼苗抗氧化系統(tǒng)對疊氮化鈉誘變的響應(yīng)。結(jié)果表明，疊氮化鈉濃度增加、誘變時間延長導(dǎo)致晉藜1號種子發(fā)芽率降低，濃度過高會使種子致死，不易發(fā)芽。當用10 mmol/L的誘變劑對晉藜1號種子處理7.5 h，發(fā)芽率為53%，接近半致死濃度。通過MDA含量的測定結(jié)果可知，相比于對照組MDA含量總體在上升，誘變濃度越大，MDA含量上升幅度越大，趨勢越明顯，表明植物細胞膜脂受到損傷程度越大[18]。而從抗氧化酶CAT、SOD的活性測定可以看出，在低濃度(<15 mmol/L)，短時間(≤5 h)時含量明顯升高，之后CAT活性變化趨于平緩，原因可能是晉藜1號對低濃度疊氮化鈉的適應(yīng)，長時間(>5 h)，高濃度(≥15 mmol/L)的疊氮化鈉誘變時CAT活性持續(xù)升高，這說明高濃度的疊氮化鈉對晉藜1號植株的毒害作用已經(jīng)超出其自身抗氧化系統(tǒng)的清除范圍；在低濃度的疊氮化鈉處理時，SOD活性上升，高濃度處理時出現(xiàn)下降，說明低濃度的疊氮化鈉刺激了SOD酶系統(tǒng)，使SOD產(chǎn)量增多，活性增強。高濃度的疊氮化鈉使晉藜1號抗氧化系統(tǒng)受到抑制，SOD的活性降低。經(jīng)誘變后，脯氨酸含量呈上升趨勢，低濃度時增加平緩，高濃度時急劇上升。

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各類文獻規(guī)范數(shù)據(jù)選項表

注：“√”為必備項，“0”為任選項，“*”為有則加項，“-”為不要求項。