采后伽師瓜和86-1甜瓜果實抗鏈格孢菌侵染研究

瑪爾哈巴·帕爾哈提 白羽嘉,2 王 瑾 朱婉彤 阿迪萊·圖爾蓀 馮作山

(1. 新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830000；2. 新疆農業(yè)大學作物學博士后流動站，新疆 烏魯木齊 830000)

甜瓜(CucumismeloL.)是新疆重要的果品特產之一[1-2]。在整個生長時期，甜瓜均可能受到鏈格孢菌(Alternariaalternata)侵染而引發(fā)黑斑病。黑斑病發(fā)病初期呈淺黃褐色，后期病斑明顯變黑，病、健組織之間分界明顯，伴隨表皮凹陷，果肉呈海綿狀黑色團塊[3-5]。伽師瓜和86-1甜瓜是新疆主要甜瓜品種，多產于新疆喀什地區(qū)，其中伽師縣產量位居第一[6]。

當植物受到病原菌侵染時，往往分泌幾丁質酶(CHT)與β-1,3-葡聚糖酶(GLU)等病程相關蛋白，來提高自身防御能力。目前果實采后病程相關蛋白的研究也主要集中在CHT[7-8]和GLU上[9-10]。也有研究[11-13]表明，抗壞血酸過氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)在植物抗病性方面起著重要作用。植物受病害侵染可誘導這些保護酶產生變化，增強抗病能力[14]。目前，有關甜瓜抗病菌侵染的研究[15-17]多見于其果肉組織上，本研究擬以伽師瓜和86-1甜瓜為試材，取其果肉及果皮組織為試驗對象，比較二者抵抗病原菌侵染能力的差異，以期為選擇培育優(yōu)良甜瓜品種和甜瓜采后病害控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

伽師瓜、86-1甜瓜：采摘自新疆喀什地區(qū)伽師縣三鄉(xiāng)，選取無病蟲害、無機械損傷果實，伽師瓜單果重(4.0±0.5) kg，全生育期110～120 d，中心可溶性固形物14.0%，邊部可溶性固形物9.0%。86-1甜瓜單果重(3.5±0.5) kg，全生育期115 d左右，中心可溶性固形物14.0%，邊部可溶性固形物9.8%；

鏈格孢：分離自伽師瓜自然發(fā)病的果實，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基于4 ℃保存；

冰醋酸、無水醋酸鈉、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮(K30)、曲拉通、愈創(chuàng)木酚、30% H2O2溶液、鄰苯二酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、丙酮、濃鹽酸、鹽酸、乙醇、五水合四硼酸鉀、對二甲氨基苯甲醛、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、抗壞血酸：分析純，天津市光復精細化工研究所；

二硫蘇糖醇、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、L-蛋氨酸、氮藍四唑、核黃素：分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司；

幾丁質：分析純，美國西格瑪奧德里奇公司；

脫鹽蝸牛酶、β-巰基乙醇：分析純，上海索萊寶生物科技有限公司；

葡萄糖、瓊脂：生物試劑，北京奧博星生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：FA2104N型，上海民橋精密科學儀器有限公司；

pH計：FE20型，梅特勒-托利多儀器有限公司；

無菌操作臺：NBCJ-B型，上海鴻都電子科技有限公司；

恒溫霉菌培養(yǎng)箱：MHP-250型，上海鴻都電子科技有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

顯微鏡：XSP-2C型，上海蔡康光學儀器有限公司；

高速分散器：XHF-DY型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速冷凍離心機：TGL-16G型，上海安亭科學儀器廠；

紫外—可見分光光度計：TU-1810PC型，北京普析通用公司；

超聲波清洗器：SK2200H型，上?？茖С晝x器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-S-4型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；

氣體傳輸泵：2XZ-2型，臨海市譚氏真空設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

(1) 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的制備：將馬鈴薯去皮切塊，稱取200 g放入1 000 mL蒸餾水中煮沸至發(fā)軟，用紗布過濾，補加蒸餾水至1 000 mL。加入20 g葡萄糖與15 g瓊脂，攪拌溶解，分裝至250 mL錐形瓶，121 ℃ 高壓滅菌20 min，倒平板備用。

(2) 孢子懸浮液的制備：將保藏鏈格孢菌種的培養(yǎng)基在無菌操作臺打開，用高溫滅菌過的鑷子取適量菌落，轉移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，27 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后用顯微鏡觀察菌落特征，確認為所需菌種，收集孢子。用含有 0.01% Tween-80 的無菌水配制濃度為1×106個/mL 孢子懸浮液備用。

(3) 甜瓜預處理：用自來水沖洗，再用2%過氧化氫清洗并浸泡30 s消毒，最后用無菌水沖洗3遍，晾干備用，放入7 ℃ 冷庫預冷。

(4) 接種與取樣：在甜瓜果實赤道等距刺入3 個深度為5 mm的傷口(直徑3.5 mm)，吸取20 μL上述孢子懸浮液接入，對照組接入等量無菌水，用塑料膠條封住，裝箱，置于7 ℃、相對濕度85%～90%冷庫貯藏。

(5) 取樣：在0，3，6，9，12，15，18，21，24，27，30 d后觀察，取傷口周圍5 mm處果皮和果肉組織，液氮速凍，-80 ℃保存。每處理用果實10個。

1.2.2 病斑直徑測量 將接種鏈格孢菌的甜瓜沿3個傷口處切開，每次取4個瓜，切開的兩半瓜都測取，取平均值。

1.2.3 CHT和GLU活性測定 參照文獻[18]。

1.2.4 保護酶活性測定

(1) APX活性測定：參照文獻[19]。

(2) SOD活性測定：采用氮藍四唑光化還原法[20]。

(3) POD活性測定：參照Zauberman等[21]方法并做修改。稱取10 g冷凍果肉組織和5 g冷凍果皮組織，分別加入10，20 mL提取緩沖液(50 mmol/L pH 5.5 醋酸緩沖液，1 mmol/L 聚乙二醇6000，4 g/100 g聚乙烯吡咯烷酮K30，1 g/100 g 曲拉通)，充分研磨成勻漿后，于4 ℃、8 000×g離心30 min，上清液即為POD酶提取液。酶促反應體系：25 mmol/L 愈創(chuàng)木酚溶液3 mL，0.5 mL酶提取液， 0.5 mol/L H2O2溶液200 μL。以蒸餾水為空白，立即在波長470 nm處測定吸光度值，然后每隔1 min 測定1次，連續(xù)測定6 min。以每克鮮重樣品每分鐘吸光度值增加1時為1個POD活性單位(U)，結果以U/g表示。

(4) PPO活性測定：參照Zauberman等[21]的方法并做修改。稱取10 g冷凍果肉組織和5 g冷凍果皮組織，分別加入10，20 mL提取緩沖液(100 mmol/L pH 5.5 醋酸緩沖液，1 mmol/L聚乙二醇6000，4 g/100 g聚乙烯吡咯烷酮K30，1 g/100 g 曲拉通)，充分研磨成勻漿后，于4 ℃、8 000×g離心30 min，上清液即為PPO酶提取液。酶促反應體系：50 mmol/L、pH 5.5醋酸緩沖液4 mL， 50 mmol/L鄰苯二酚溶液1 mL，100 μL 酶提取液。以蒸餾水為參比空白，立即在波長420 nm 處測定吸光度值，然后每隔1 min 測定1次，連續(xù)測定6 min。以每克鮮重樣品每分鐘吸光度變化值增加1時為1個PPO活性單位(U)，結果以U/g表示。

1.3 數據處理

使用SPSS 20.0軟件進行差異性顯著分析，P<0.05 表示差異顯著，利用Excel 2016進行數據處理及繪圖，試驗重復3次。結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 鏈格孢侵染甜瓜果實病斑直徑的變化

病斑直徑可直接反映果實的病情變化。由圖1可知，第12天2種甜瓜均開始出現(xiàn)黑色病斑，由果皮向果肉發(fā)散擴大，與蔣黎艷等[22]對溫州蜜柑的研究結果相一致。果皮和果肉的病斑直徑隨著貯藏天數的增加均逐漸擴大，果肉病斑直徑始終大于果皮。但與86-1甜瓜相比，伽師瓜病斑直徑擴展相對較慢。第30天，86-1甜瓜果皮和果肉病斑直徑分別是伽師瓜果皮和果肉的1.14，1.06倍。從甜瓜組織分析，果皮較果肉可顯著抑制甜瓜的鏈格孢病斑直徑擴大(P<0.05)，病斑直徑增長速度比果肉慢，與其它品種相比，伽師瓜比86-1甜瓜對抵御鏈格孢病菌侵染具有更強能力，且病斑直徑增長速度低于86-1甜瓜。同時本試驗還發(fā)現(xiàn)，伽師瓜和86-1甜瓜果皮和果肉在同一天開始出現(xiàn)病斑，與張培嶺等[23]的研究結果一致。

圖1 鏈格孢侵染對2種甜瓜病斑直徑的影響Figure 1 Effects of Alternaria alternata infection on the lesions diameter of two melons

2.2 鏈格孢侵染對甜瓜果實病程相關蛋白活性的影響

2.2.1 CHT活性 病原菌引起植物抗病性機制不是單一的機制，存在著多種機制甚至是多種機制協(xié)同作用的結果[24]。大部分病原菌細胞壁的主要成分含有幾丁質，而CHT可以有效地將其分解，從而破壞病原菌結構達到抑制病原菌的作用[25]。由圖2可知，貯藏期間2種甜瓜果皮和果肉的CHT活性都呈先上升后下降的趨勢。伽師瓜和86-1甜瓜接種果皮分別在18～30，15～21 d CHT活性保持較高水平，說明甜瓜自身的抗病系統(tǒng)在這段時間發(fā)揮顯著作用，導致酶活性升高。9 d前各處理增長緩慢，在此之后迅速增長并相繼出現(xiàn)高峰，高峰之后緩慢下降，且2種甜瓜接種果皮均高于對照。伽師瓜接種果皮在第21天出現(xiàn)明顯高峰，是對照峰值的1.75倍。86-1甜瓜接種果皮CHT活性峰值提前3 d出現(xiàn)，是對照峰值的1.77倍，但僅為伽師瓜接種果皮峰值的50.74%。2種甜瓜接種果肉CHT活性變化較對照果肉更明顯。伽師瓜接種果肉CHT活性變化在第9天后迅速增大，在第18～24天保持較高CHT活性。86-1甜瓜接種果肉從第3天后CHT活性明顯增加，在第6～9天活性高于伽師瓜接種果肉，但差異不顯著，第18天出現(xiàn)CHT活性峰值，是伽師瓜接種果肉峰值的79.17%。單春會[26]將青霉菌接種于伽師瓜發(fā)現(xiàn)果實中CHT在不同侵染階段啟動相應反應，這與本研究結果相似。

2.2.2 GLU活性 GLU存在于大部分高等植物中，與CHT協(xié)同作用下可明顯抑制病原菌的生長[27]。由圖3可知，整個貯藏期間2種甜瓜果皮和果肉GLU活性都呈先上升后下降的趨勢，與果實CHT活性有著相似變化。對于果皮，伽師瓜接種果皮GLU活性持續(xù)上升，在第24天出現(xiàn)峰值，86-1甜瓜接種果皮GLU活性緩慢上升，提前3 d達到最大活性值。伽師瓜和86-1甜瓜接種果皮均高于對照(P<0.05)。果肉趨勢與果皮相似，2種甜瓜果肉接種組均在第21天出現(xiàn)GLU活性峰值。伽師瓜接種果肉在第9天迅速升高隨后出現(xiàn)明顯峰值，是對照的2.42倍，這與CHT在伽師瓜接種果肉中活性變化表現(xiàn)相似，說明CHT可以和GLU協(xié)同，產生強烈抵抗作用，共同抵御鏈格孢菌侵染。86-1甜瓜接種果肉在貯藏前期GLU活性表現(xiàn)平緩，第21天達到GLU活性高峰后緩慢下降。柴喜榮等[28]發(fā)現(xiàn)黃瓜抵御疫病過程中，果實中GLU與CHT均顯著增加，并與黃瓜品種抗病性呈正相關。這表明，當植物受到病原菌侵染時，往往分泌CHT與GLU等病程相關蛋白，來提高自身防御能力。

圖2 鏈格孢侵染對2種甜瓜CHT活性的影響Figure 2 Effects of Alternaria alternata infection on CHT activity of two melons

圖3 鏈格孢侵染對2種甜瓜GLU活性的影響Figure 3 Effects of Alternaria alternata infection on GLU activity of two melons

2.3 鏈格孢侵染對甜瓜果實保護酶活性的影響

2.3.1 APX活性 保護酶也與植物體抗病、抗病原菌入侵能力密切相關。APX可以有效清除細胞內多種脅迫環(huán)境下產生的過多活性氧，使果實體系處于相對平衡狀態(tài)，對細胞產生保護作用[29]。由圖4可知，隨著貯藏天數的延長，2種甜瓜果皮和果肉的APX活性都不斷上升，在第30天有最大活性值。對于果皮，伽師瓜接種果皮在第15天迅速升高，而86-1甜瓜接種果皮總體緩慢上升，在上升期間，前者約是后者的2倍。對于果肉，伽師瓜接種果肉APX活性在第9天明顯升高，同時期86-1甜瓜接種果肉增長緩慢，說明APX在伽師瓜接種果肉貯藏前期就起到保護作用，一直維持到貯藏結束。有研究[30]表明，經吡唑并嘧啶衍生物誘導的黃瓜接種尖孢鐮孢菌后，保護酶APX活性有所提高，且有APX基因表達。

2.3.2 SOD活性 由圖5可知，貯藏期間2種甜瓜的果皮和果肉SOD活性都呈先上升后下降的趨勢。對于果皮，伽師瓜接種果皮SOD活性漲幅趨勢明顯，其他處理SOD活性變化波動不大，可能是受鏈格孢菌侵染，伽師瓜接種果皮在這段時間內產生大量活性氧，誘導SOD活性提高，起到了防御氧自由基產生的第一道防線作用[31]。伽師瓜和86-1甜瓜接種果皮分別在第18天和第21天出現(xiàn)活性高峰，前者是后者的3.67倍。對于果肉，伽師瓜和86-1甜瓜接種果肉SOD活性變化相似，峰值均在貯藏第21天出現(xiàn)，伽師瓜接種果肉SOD活性整體顯著高于86-1甜瓜的(P<0.05)。2種甜瓜果肉組SOD活性變化較果皮組平緩，可能是甜瓜受鏈格孢病菌侵染后，果皮比果肉發(fā)揮更積極的抵御作用。研究[32]發(fā)現(xiàn)，對不同感抗品種柑橘經毒素處理，抗性品種柑橘SOD活性分別在處理初期和末期出現(xiàn)2次活性最大值。

圖4 鏈格孢侵染對2種甜瓜APX活性的影響Figure 4 Effects of Alternaria alternata infection on APX activity of two melons

圖5 鏈格孢侵染對2種甜瓜SOD活性的影響Figure 5 Effects of Alternaria alternata infection on SOD activity of two melons

2.3.3 POD活性 POD一方面在清除、阻止活性氧形成起著重要作用，另一方面，它與一些抗性物質如總酚、黃酮、木質素等的合成有緊密聯(lián)系[33-34]。由圖6可知，貯藏期間伽師瓜和86-1 2種甜瓜的果皮和果肉POD活性都呈先上升后下降的趨勢。對于果皮，伽師瓜接種果皮在第12～18天連續(xù)出現(xiàn)較高POD活性，并在第12天出現(xiàn)POD活性峰值，整個貯藏期間POD活性均高于對照(P<0.05)。86-1甜瓜接種果皮在第18天緩慢上升到高峰值后迅速下降，除第24天和第27天外，POD活性均高于對照(P<0.05)。對于果肉，伽師瓜接種果肉在貯藏前期POD活性直線上升，第12天出現(xiàn)POD活性峰值隨后急劇下降。86-1甜瓜接種果肉在第6天迅速達到POD活性高峰后緩慢下降。同樣的結果在香蕉果實中也有發(fā)現(xiàn)[35]。

2.3.4 PPO活性 PPO活性的增加是果實受病原菌侵染后發(fā)生的典型變化，PPO與POD兩者協(xié)同可以為果實細胞提供防御，以減少病原菌造成的傷害，因此被認為是植物的保護酶之一[36]。由圖7可知，貯藏期間2種甜瓜果皮和果肉的PPO活性都呈先上升后下降的趨勢。對于果皮，伽師瓜果皮PPO活性峰值較86-1甜瓜晚12 d出現(xiàn)，除第12天外，伽師瓜接種果皮PPO活性均大于86-1甜瓜，說明PPO在貯藏后期對伽師瓜果皮抵御病原菌侵染起了主要作用，且抵抗作用

圖6 鏈格孢侵染對2種甜瓜POD活性的影響Figure 6 Effects of Alternaria alternata infection on POD activity of two melons

圖7 鏈格孢侵染對2種甜瓜PPO活性的影響Figure 7 Effects of Alternaria alternata infection on PPO activity of two melons

大于86-1甜瓜。對于果肉，伽師瓜接種果肉在第12天出現(xiàn)明顯PPO活性峰值，是對照的1.26倍。86-1甜瓜接種果肉在第18天出現(xiàn)PPO活性峰值，是對照的1.06倍。第15天開始，86-1甜瓜接種和對照果肉均高于伽師瓜接種和對照果肉，這是因為伽師瓜在前期表現(xiàn)較強烈的抵御作用，隨著時間的推移慢慢減少，導致PPO活性低于86-1甜瓜。同樣在不同品種蘋果果實對抗灰霉病時，PPO活性表現(xiàn)為高抗品種高于感病品種高于高感品種[37]。

3 結論

本研究結果表明，伽師瓜病斑直徑小于86-1甜瓜，果皮病斑直徑小于果肉，說明伽師瓜比86-1甜瓜能更好地抵御鏈格孢侵染，其果皮也比果肉能更好保護果實不受病原菌損害。整個貯藏期間，增強的CHT、GLU、APX、SOD、POD和PPO活性與甜瓜果實對鏈格孢侵染抗病性緊密相關。與86-1甜瓜相比，伽師瓜果實中CHT、GLU、APX、SOD、POD和PPO活性更高。說明伽師瓜比86-1甜瓜有更積極的防御鏈格孢侵染作用，尤其在貯藏中后期作用顯著。今后的研究重點可以從同工酶電泳和分子水平等方向深入闡述甜瓜果實對鏈格孢侵染的抗病性機制，挖掘影響甜瓜抗病性的關鍵基因及代謝途徑。