性激素對雌、雄尼羅羅非魚消化酶活性和攝食基因表達的影響

岳蒙蒙，趙金良

( 上海海洋大學，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306 )

脊椎動物雌、雄生長差異受攝食、消化、生長與生殖能量配置等影響[1]。魚類存在著兩性生長差異現(xiàn)象，對鱖魚(Sinipercachuatsi)、羅非魚(Oreochromis)等研究發(fā)現(xiàn)，雌雄生長差異出現(xiàn)與其性成熟時間相關(guān)[2-3]。尼羅羅非魚(O.niloticus)雄魚較雌魚生長更快，且在性成熟時差異更加明顯，推測雌雄生長差異受體內(nèi)性類固醇激素影響[4]。在羅非魚中發(fā)現(xiàn)，11-酮睪酮可通過提高攝食量使雄性迅速生長。

腦腸肽是一類廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和消化道的多肽，多由消化道分泌作用于下丘腦的攝食調(diào)節(jié)中樞，直接或間接參與攝食調(diào)節(jié)，主要分為攝食促進作用和攝食抑制作用[6]。腦腸肽ghrelin是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一種具有攝食促進作用的腦腸肽[5]，J?nsson等[7]發(fā)現(xiàn)不同喂養(yǎng)條件下虹鱒(Oncorhynchusmykiss)血清腦腸肽含量與進食量呈正相關(guān)。Sakurai等[8]發(fā)現(xiàn)了與G蛋白偶聯(lián)的重要神經(jīng)肽食欲素，攝食狀態(tài)中尼羅羅非魚食欲素基因前體的表達量較攝食前、攝食后均有顯著性提高，預示食欲素可能作為攝食信號參與攝食調(diào)控[9]。神經(jīng)肽Y于1982年從豬腦中首次分離，屬于多肽家族，是一種內(nèi)源性促食欲因子[10]。饑餓使鯽魚(Carassiusauratus)、銀大麻哈魚(O.kisutch)腦中神經(jīng)肽mRNA表達量增加，重新投喂餌料后將產(chǎn)生相反影響[11-12]。1994年，從肥胖小鼠中克隆出OB基因，其編碼信號肽命名為瘦素，在金魚中外周和中樞注射瘦素均會降低攝食[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，草魚(Ctenopharyngodonidellus)、青鱸(Nibeajaponica)禁食后，膽囊收縮素基因表達量顯著降低，膽囊收縮素是攝食調(diào)控因子[15-16]。

攝食是魚類獲取營養(yǎng)和能量的唯一途徑，為個體存活、生長、發(fā)育及繁殖提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。魚類的攝食消化能力直接影響生長速度，一般而言，攝食消化能力強則個體生長較快。已有研究表明，金錢魚(Scatophagusargus)2齡以下雌性生長快于雄魚，與其具有較高的攝食量、食物轉(zhuǎn)化率、蛋白酶和淀粉酶活性有關(guān)[17]；在灰海馬(Hippocampuserectus)中發(fā)現(xiàn)，相同飼養(yǎng)條件下，雌性蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶顯著高于雄性，推測雌性需要更多能量用于性腺發(fā)育[18]。目前，關(guān)于性類固醇激素對雌雄尼羅羅非魚攝食基因及消化酶的研究未見報道，筆者通過測定雌雄尼羅羅非魚腦腸肽、瘦素、神經(jīng)肽Y、食欲素、膽囊收縮素mRNA表達量，結(jié)合淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性，探究性類固醇激素對雌雄魚攝食消化的影響，為尼羅羅非魚養(yǎng)殖提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

尼羅羅非魚取自于上海海洋大學羅非魚種質(zhì)資源試驗站，為新吉富羅非魚(O.niloticus)，全長為(15.9±1.3) cm，體質(zhì)量為(62.2±13.1) g。運回實驗室后，在0.6 m×0.5 m×0.4 m室內(nèi)控溫循環(huán)水族箱中暫養(yǎng)兩周以適應新環(huán)境，水溫(23±0.8) ℃。暫養(yǎng)期間日投喂兩次，分別為8：00、18：00，試驗前12 h不投喂。

1.2 試驗方法

雌雄試驗魚分別分為3組，即雌二醇處理組、睪酮處理組和對照組，每組3個重復，每個重復5～6尾魚。雌二醇和睪酮均為美國Sigma公司產(chǎn)品，無水乙醇溶解后植物油稀釋(1∶10，體積比)后腹腔注射，劑量為50 μg/g，對照組僅注射無水乙醇∶植物油=1∶10(體積比)混合液。

注射后第6、12、24 h全部采樣，進行生物學測定之后，置于冰盤上解剖，取出腦組織，于冰箱-80 ℃保存?zhèn)溆?；在冰上分離出胃、腸組織，清除脂肪和內(nèi)容物備用、剔除脂肪和結(jié)締組織。

1.2.1 胃、腸組織蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性測定

胃、腸組織先用4 ℃冰凍蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干迅速稱量質(zhì)量并放入標記管中，置于冰箱-80 ℃保存。取出樣本，分別加20倍4 ℃蒸餾水冰浴勻漿，勻漿液于冰箱4 ℃靜置1 h后，4 ℃，3000 r/min離心30 min，取上清液于冰箱4 ℃保存，24 h內(nèi)測定酶活力。

采用福林—酚試劑法測定蛋白酶活性，以37 ℃水浴15 min，每分鐘內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸作為1個酶活力單位(U)。

淀粉酶活性測定以可溶性淀粉為底物，采用3，5-二肖基水楊酸顯色法，在pH 6.9和25 ℃條件下，每分鐘催化淀粉生成1 mg麥芽糖定為一個酶活力單位(U)[17]。

脂肪酶活力采用南京建成脂肪酶試劑盒測定。脂肪酶活性定義，1 g組織樣品在37 ℃測定條件下，每分鐘水解對硝基苯磷酸二鈉鹽產(chǎn)生1 μmol對硝基苯酚定義為1個酶活性單位(U)。

1.2.2 攝食相關(guān)基因相對表達

1.2.2.1 總RNA提取

使用CWBio公司Trizol試劑盒提取腦組織中總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用One DropTMSpectrophotometer測定總RNA純度及含量，-80 ℃低溫保存。

1.2.2.2 cDNA的合成

將總RNA稀釋至500 ng/μL，使用CWBio公司SuperRT cDNA Synthesis Kit進行RT-PCR擴增，具體操作按試劑盒說明進行，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放入4 ℃冰箱保存。

1.2.2.3 引物設(shè)計

參照GenBank中羅非魚攝食相關(guān)基因腦腸肽、瘦素、食欲素、神經(jīng)肽Y、膽囊收縮素、β-actin cDNA序列，用Primer premier 5.0軟件設(shè)計各基因特異性引物(表1)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 實時熒光定量PCR所用引物

1.2.2.4 實時熒光定量PCR擴增

Real-time PCR擴增參照UltraSYBR Mixture說明書進行，擴增程序為：95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s, 65～95 ℃熔解。所有樣品重復3次，根據(jù)結(jié)果調(diào)整擴增反應體系，使目的基因和內(nèi)參基因擴增效率接近100%。用2-ΔΔCt法計算攝食基因mRNA相對表達水平[19]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用Excel 2007軟件進行分析，試驗結(jié)果以平均值±標準差表示，使用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析，利用單因素方差分析法對數(shù)據(jù)進行方差分析，差異顯著時用Duncan′s法多重比較，P<0.05為差異顯著。采用Sigma Plot 10.0制作圖表。

2 結(jié) 果

2.1 注射雌二醇、睪酮雌雄魚胃、腸道消化酶活性的影響

注射后12 h時，胃總蛋白酶活性最高，對照組雄魚胃蛋白酶活性顯著高于雌魚(P<0.05)，其他時間點雌、雄魚活性差異不明顯。外源性類固醇激素對雌、雄魚胃蛋白酶活力影響不明顯(P>0.05)(圖1)。

對照組雌、雄魚淀粉酶活性差異不明顯，12 h腸總淀粉酶活性最高。24 h體外注射睪酮顯著升高雄魚腸總淀粉酶活性，其他時間外源性類固醇激素對雌、雄魚腸總淀粉酶活力影響不明顯(P>0.05)，注射第12 h，腸總淀粉酶活性最高(圖2)。

12 h時，雄魚腸總脂肪酶活性顯著高于雌魚(P<0.05)，其他時間點雌、雄魚差異不明顯，12 h對照組雌、雄魚腸總脂肪酶活性最高。外源性類固醇激素對雌、雄魚腸總脂肪酶活力影響不明顯(P>0.05)(圖3)。

圖1 性類固醇激素對雌、雄尼羅羅非魚胃總蛋白酶活性的影響

圖3 性類固醇激素對雌、雄尼羅羅非魚腸總脂肪酶活性的影響

2.2 注射雌二醇、睪酮對攝食基因表達量的影響

2.2.1 腦腸肽mRNA

注射雌二醇、睪酮6 h后顯著升高雌魚腦腸肽mRNA水平(P<0.05)，雌二醇升高效果較睪酮更明顯;注射雌二醇、睪酮 6 h后，可快速、明顯的提高雄魚腦腸肽mRNA的表達(P<0.05)，睪酮升高效果較雌二醇更明顯，雌二醇、睪酮對雌、雄魚腦組織腦腸肽mRNA表達的作用顯示出明顯的性別二態(tài)性(圖4)。6、12、24 h隨時間推移，雌二醇對雌魚及睪酮對雄魚腦腸肽mRNA表達量的升高作用逐漸平緩。

圖4 性類固醇激素對雌、雄尼羅羅非魚腦組織腦腸肽mRNA水平的影響

2.2.2 瘦素mRNA

注射雌二醇6、24 h時顯著升高雌魚瘦素mRNA水平(P<0.05)，12 h影響不顯著(P>0.05)，注射睪酮顯著降低雌魚瘦素mRNA水平(P<0.05)；6 h雌二醇顯著升高雄魚瘦素mRNA水平(P<0.05)，而其他時間點影響不顯著，睪酮顯著降低雄魚瘦素mRNA水平(P<0.05)(圖5)。

2.2.3 食欲素mRNA

注射雌二醇12、24 h顯著升高雌魚食欲素mRNA(P<0.05)，對雄魚影響不明顯；相反，注射睪酮24 h時顯著升高雄魚食欲素mRNA(P<0.05)，對雌魚影響不明顯(圖6)。

2.2.4 神經(jīng)肽Y mRNA

性類固醇激素對尼羅羅非魚腦組織神經(jīng)肽Y mRNA表達的調(diào)節(jié)同樣存在雌雄差異性。注射雌二醇6 h后，明顯促進雌魚神經(jīng)肽Y mRNA表達(P<0.05)，對雄魚表達影響不明顯；注射睪酮對雌、雄魚神經(jīng)肽Y mRNA表達影響不明顯，6 h后可顯著升高雄魚的表達，24 h進一步上調(diào)腦組織神經(jīng)肽Y mRNA表達(圖7)。

2.2.5 膽囊收縮素mRNA

注射雌二醇6、12、24 h顯著降低雌魚膽囊收縮素mRNA表達量(P<0.05)，雌二醇對雄魚無顯著影響；睪酮對雌魚膽囊收縮素mRNA表達無顯著影響，6 h后顯著降低雄魚表達量。

圖5 性類固醇激素對雌、雄尼羅羅非魚腦組織瘦素mRNA 水平的影響

圖6 性類固醇激素對雌、雄尼羅羅非魚腦組織食欲素mRNA水平的影響

圖7 性類固醇激素對雌、雄尼羅羅非魚腦組織神經(jīng)肽Y mRNA 水平的影響

圖8 性類固醇激素對雌、雄尼羅羅非魚腦組織膽囊收縮素mRNA水平的影響

3 討 論

對脊椎動物來說，攝食能力強則生長更快。有研究發(fā)現(xiàn)，性類固醇激素參與調(diào)節(jié)攝食過程[1]。歐鱸(Percafluviatilis)雌魚較雄魚體長更長，雌、雄性別分化明顯，在同時升高雌、雄魚性類固醇激素水平時，食物攝食率降低[4]。在銀大麻哈魚、鯉魚(Cyprinuscarpio)、大鱗大麻哈魚(O.tschawytscha)的研究中發(fā)現(xiàn)，性類固醇激素升高，引起攝食量相應升高[4]。

消化酶是消化系統(tǒng)分泌的具有催化食物分解的一類酶，其活性的強弱直接影響到魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進而影響魚類生長發(fā)育。本試驗中，在消化能力方面即餌料效率，雄魚顯著高于雌魚，12 h對照組雄魚胃總蛋白酶、腸總脂肪酶活力較雌魚更高，可能是雄魚生長快速需要更多能量，因此相應升高消化酶活性來消化食物。除此之外，雄魚從外界獲取更多食物，這與前人研究結(jié)果一致，羅非魚雄魚較雌魚攝食量、消化管(胃、腸)、餌料效率、單位重量的攝食率更高[21]。本試驗中，除了注射后12 h，睪酮顯著升高雄魚淀粉酶活性，其他時間性類固醇激素對消化酶活性影響不顯著，表明消化酶活性大小并不是性類固醇激素調(diào)節(jié)雌雄生長的主要原因。

本試驗中，對照組雌雄攝食基因腦腸肽、瘦素、食欲素、膽囊收縮素、神經(jīng)肽Y表達量隨時間變化不明顯，雌二醇和睪酮對雌、雄魚均表現(xiàn)出明顯調(diào)節(jié)作用，且這種調(diào)節(jié)作用對膽囊收縮素、腦腸肽、瘦素具有雌、雄差異性：雌二醇顯著升高雌魚、睪酮顯著升高雄魚腦腸肽表達量，6、24 h，雌二醇顯著降低雌魚、睪酮顯著降低雌雄魚瘦素表達量，性類固醇激素可通過調(diào)節(jié)外周抑制攝食因子瘦素、膽囊收縮素參與調(diào)節(jié)羅非魚食欲降低和能耗增加，這與已有研究結(jié)果一致。研究表明，對金魚(Carassiusauratus)中樞及外周注射腦腸肽，具有顯著促進攝食和增加體質(zhì)量的作用[22]。荷那龍羅非魚(O.hornorum)饑餓4周后，饑餓組中胃組織腦腸肽基因表達量最高的個體較對照組表達量最低的個體增加了47.3倍[23]。魚類瘦素基因具有抑制攝食、控制體質(zhì)量的功能[24]。提示雌二醇、睪酮通過對腦腸肽、瘦素基因的調(diào)節(jié)，進一步升高或降低攝食量，從而影響雌、雄生長。

這些研究結(jié)果表明，性類固醇激素影響下，攝食調(diào)控因子相互作用，相應調(diào)節(jié)魚體攝食機能及能量動態(tài)平衡，進一步可能影響羅非魚雌、雄生長差異的產(chǎn)生。

[1] Johannsson G, Gibney J, Wolthers T, et al. Independent and combined effects of testosterone and growth hormone on extracellular water in hypopituitary men[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2005, 90(7):3989-3994.

[2] 王曉清, 李傳武, 謝中國,等. 鱖雌雄生長差異的研究[J]. 淡水漁業(yè), 2006, 36(3):34-37.

[3] 岳蒙蒙, 趙金良, 唐首杰,等. 性成熟前期尼羅羅非魚雌雄性別生長差異與性類固醇激素水平比較[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報, 2016, 28(10):1678-1686.

[4] Mandiki S N M, Babiak I, Bopopi J M, et al. Effects of sex steroids and their inhibitors on endocrine parameters and gender growth differences in Eurasian perch (Percafluviatilis) juveniles[J]. Steroids, 2005,70(2):85-94.

[5] N?slund E, Hellstr?m P M. Appetite signaling: from gut peptides and enteric nerves to brain[J]. Physiology & Behavior, 2007, 92(1/2):256-262.

[6] 陳勇,李家樂,沈玉幫,等. 草魚ghrelin基因的分子克隆與組織分布及其攝食調(diào)控作用分析[J]. 水產(chǎn)學報,2012,36(5):663-671.

[7] J?nsson E, Forsman A, Einarsdottir I E, et al. Plasma ghrelin levels in rainbow trout in response to fasting, feeding and food composition, and effects of ghrelin on voluntary food intake[J]. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A Molecular & Integrative Physiology, 2007, 147(4):1116-1124.

[8] Silva E S D, Flores R A,Ribas A S, et al. Injections of the α 1 -adrenoceptor antagonist prazosin into the median raphe nucleus increase food intake and Fos expression in orexin neurons of free-feeding rats[J]. Behavioural Brain Research, 2017, 324(1):87.

[9] 陳文波, 王鑫, 周雅璐,等. 尼羅羅非魚Orexin前體基因的克隆、組織分布及其在攝食調(diào)控中的表達[J]. 動物學研究, 2011, 32(3):285-292.

[10] Oliveira M M, Akerman S, Tavares I, et al. Neuropeptide Y inhibits the trigeminovascular pathway through NPY Y1 receptor: implications for migraine[J]. Pain, 2016, 157(8):1666.

[11] Kehoe A S,Volkoff H. Cloning and characterization of neuropepitide Y (NPY) and cocaine and amphetamine regulated transcript (CART) in Atlantic cod [J]. Comparative Biochemistry and Physiology, 2007,146(3):451-461.

[12] Peterson B C,Waldbieser G C, Riley L G, et al. Pre- and postprandial changes in orexigenic and anorexigenic factors in channel catfish [J]. General & Comparative Endocrinology, 2012, 176(2):231-239.

[13] Milaneschi Y, Lamers F, Bot M, et al. Leptin dysregulation is specifically associated with major depression with atypical features: evidence for a mechanism connecting obesity and depression[J]. Biological Psychiatry, 2015, 882(11):660-662.

[14] Tinoco A B, Nisembaum L G, Isorna E, et al. Leptins and leptin receptor expression in the goldfish (Carassiusauratus). Regulation by food intake and fasting/overfeeding conditions[J]. Peptides, 2012, 34(2):329-335.

[15] Feng K, Zhang G R, Wei K J, et al. Molecular characterization of cholecystokinin in grass carp (Ctenopharyngodonidellus): cloning, localization, developmental profile, and effect of fasting and refeeding on expression in the brain and intestine[J]. Fish Physiology & Biochemistry, 2012, 38(6):1825-1834.

[16] Babichuk N A, Volkoff H. Changes in expression of appetite-regulating hormones in the cunner (Tautogolabrusadspersus) during short-term fasting and winter torpor[J]. Physiology & Behavior, 2013, 120(5):54-63.

[17] 吳波, 葉滿, 陳孌孌,等. 不同性別養(yǎng)殖金錢魚生長性能及消化酶活性的比較[J]. 上海海洋大學學報, 2013, 22(4):545-551.

[18] 席寅峰, 張東, 施兆鴻. 投喂頻率對雌雄分化后灰海馬生長發(fā)育、餌料轉(zhuǎn)換效率及消化酶活力的影響[J]. 海洋漁業(yè), 2013, 35(1):77-85.

[19] Faccini S, Mattia A D, Chiapponi C, et al. Development and evaluation of a new Real-Time RT-PCR assay for detection of proposed influenza D virus[J]. Journal of Virological Methods, 2017, 243(1):31-34.

[20] 袁登越. 齊口裂腹魚Leptin、CCK、PYY和CART基因的克隆、組織表達及攝食功能研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學, 2014.

[21] 馬細蘭, 張勇, 陳勇智,等. 性類固醇激素E2、MT對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)雌、雄生長差異的影響[J]. 海洋與湖沼, 2015, 46(6):1487-1493.

[22] Blanco A M,Bertucci J I, Sánchezbretao A, et al. Ghrelin modulates gene and protein expression of digestive enzymes in the intestine and hepatopancreas of goldfish (Carassiusauratus) via the GHS-R1a: possible roles of PLC/PKC and AC/PKA intracellular signaling pathways[J]. Molecular & Cellular Endocrinology, 2017(442):165-181.

[23] 高風英,王歡,盧邁新,等. 荷那龍羅非魚ghrelincDNA的克隆及表達特征[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報,2010,29(6):752-757.

[24] De P N,Martínez-Alvarez R, Delgado M J. Acute and chronic leptin reduces food intake and body weight in goldfish (Carassiusauratus)[J]. Journal of Endocrinology, 2006, 188(3):513-520.

[25] Novak C M, Jiang X, Wang C, et al. Caloric restriction and physical activity in zebrafish (Daniorerio)[J]. Neuroscience Letters, 2005, 383(1/2):99-104.

[26] Campos V F,Robaldo R B, Deschamps J C, et al. Neuropeptide Y gene expression around meal time in the Brazilian flounderParalichthysorbignyanus[J]. Journal of Biosciences, 2012, 37(2):227-232.