草魚病原菌AvX005的分離鑒定及其拮抗菌篩選研究

何 濤，鄒 升，龔 亮，趙 峰，周朋吉，李艷平，曹麗娜，丁學(xué)知，夏立秋

( 湖南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，微生物分子生物學(xué)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410081 )

草魚(Ctenopharyngodonidellus)作為我國產(chǎn)量較大的淡水魚類養(yǎng)殖品種，具有生長快、飼料蛋白需求低、肉質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)[1]。然而隨著草魚集約化養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大、養(yǎng)殖密度增加，導(dǎo)致養(yǎng)殖水質(zhì)變差，草魚重大病害爆發(fā)日益頻繁，其中細(xì)菌性疾病最為嚴(yán)重，制約和危害了草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。2016年4—7月，湖南望城喬口漁場爆發(fā)了較大范圍的草魚疾病，發(fā)病草魚均表現(xiàn)為游動(dòng)緩慢、反應(yīng)遲鈍，體表發(fā)黑，胸鰭鰭條基部和局部魚體肌肉出現(xiàn)出血癥狀，肛門紅腫，鰓絲呈灰白，部分魚體出現(xiàn)脫鱗。該病持續(xù)時(shí)間長，短期內(nèi)可導(dǎo)致草魚大量死亡。因此分離并鑒定草魚細(xì)菌性疾病病原對草魚病害的有效防治具有重要意義。

我國水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病防治中，抗菌類藥物發(fā)揮了重要作用[2]。然而此類藥物的過量使用，也帶來了越來越多的問題，如病原菌的抗藥性，養(yǎng)殖水體的菌群失調(diào)，以及藥物殘留對生態(tài)環(huán)境污染問題[3]。近年來，生物防治成為研究熱點(diǎn)，拮抗菌以其無殘留、綠色安全等優(yōu)點(diǎn)逐漸替代抗生素，得到越來越多的關(guān)注。目前研究比較多的水產(chǎn)益生菌主要有乳酸菌、芽孢桿菌(Bacillus)、光合細(xì)菌、硝化細(xì)菌等，其中部分已被廣泛應(yīng)用于水質(zhì)調(diào)控和飼料添加劑，然而在針對特定病原的拮抗菌研究相對較少。因此，加強(qiáng)病原菌拮抗菌的理論研究和應(yīng)用開發(fā)，有助于更快、更好的服務(wù)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。筆者自湖南望城喬口爆發(fā)病魚池的病魚體內(nèi)分離純化獲得一株優(yōu)勢菌株，經(jīng)回復(fù)感染試驗(yàn)?zāi)苁共蒴~致死，對該病原菌進(jìn)行了生理生化特性和分子鑒定，并篩選其拮抗菌，分離純化抑菌活性物質(zhì)，利用LC-MS/MS鑒定該物質(zhì)及其分子量，以期為漁場該病原的檢測和生物防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

患病草魚及本試驗(yàn)草魚均為常規(guī)草魚品種，患病草魚取自爆發(fā)魚病的湖南望城喬口漁場，每尾體質(zhì)量約100 g，體長約12 cm。健康草魚取自實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖基地，每尾體質(zhì)量約100～120 g，于實(shí)驗(yàn)室水族箱飼養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g， 酵母提取物5 g，氯化鈉10 g， 超純水1000 mL；LB固體培養(yǎng)基：在液體LB培養(yǎng)基中加2%的瓊脂粉。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖18 g，蛋白胨14.5 g，KH2PO42.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，MnSO40.02 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g，超純水1000 mL。

1.3 主要試劑及儀器

細(xì)菌基因組提取試劑盒，PMD-18T載體，質(zhì)粒提取試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自上海生工生物試劑有限公司；TaKaRa Ex TaqDNA 酶，DL-5000Marker購自寶生物工程(大連)有限公司。冷場電子掃描顯微鏡(Hitachi Su8010)購自日立公司，超高效液相色譜儀UHPLC(Agilent 1290)購自美國安捷倫公司，凝膠成像儀購自美國Kodak公司，PCR 擴(kuò)增儀購自德國Eppendorf公司，電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.4 病原菌的分離

將同一批具有典型癥狀的患病草魚，用75%的酒精棉擦拭體表后于超凈工作臺中無菌條件下解剖，分別取鰓、心、肝、胰、腎組織加無菌水研磨搗碎，吸取上清液稀釋涂布于固體LB培養(yǎng)基平板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后挑取優(yōu)勢單菌落再次劃線純化，純化的菌株接種于液體LB培養(yǎng)基中于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h，保種于25%無菌甘油中，冰箱中-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 回復(fù)感染試驗(yàn)

取冰箱中-80 ℃凍存的菌株活化，擴(kuò)大培養(yǎng)后，離心收集菌體，用0.85%無菌生理鹽水將其稀釋制備成1×109cfu/mL、1.0×108cfu/mL的菌懸液。將試驗(yàn)用的健康草魚隨機(jī)分組，每組10尾。試驗(yàn)采用曝曬24 h后的自來水作為養(yǎng)殖水體，水溫控制在20～23 ℃，采用腹腔注射法。腹腔注射分為3組：第1組注射1.0×109cfu/mL菌懸浮液，第2組注射1.0×108cfu/mL菌懸浮液，對照組注射0.85%無菌生理鹽水，注射量均為0.2 mL/尾。觀察14 d，記錄魚體癥狀和死亡情況?；疾≡囼?yàn)魚按照1.4方法進(jìn)行細(xì)菌的再分離。

1.6 病原菌的分類與鑒定

1.6.1 病原菌形態(tài)觀察

病原菌在LB培養(yǎng)基上于37 ℃培養(yǎng)20 h后，觀察和記錄菌落形態(tài)特征。挑取單菌落于載玻片上滴加3～5 μL的無菌水制成菌懸液，進(jìn)行涂片、固定和革蘭氏染色后在ZISS光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。同時(shí)將細(xì)菌涂布制片，在冷場電子束掃描電子顯微鏡下觀察菌體超微結(jié)構(gòu)。

1.6.2 分子鑒定

1.6.2.1 16S rDNA的擴(kuò)增與測序

菌株于37 ℃振蕩搖床培養(yǎng)16 h，利用細(xì)菌基因組提取試劑盒(生工)提取細(xì)菌基因組，利用通用引物擴(kuò)增維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)的16S rDNA的全長序列，引物序列為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，序列預(yù)期長度約為1500 bp。PCR反應(yīng)體系20 μL。含有10× PCR Ex Taq Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1.6 μL，上游引物0.6 μL(10 pmol/L)、下游引物 0.6 μL(10 pmol/L)，模板 1 μL，TaKaRa Ex Taq(5 U/μL) 0.2 μL，ddH2O 14 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，最后延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收?；厥债a(chǎn)物用PMD-18T vector進(jìn)行連接，之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichiacoli)Top10感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行氨芐抗性篩選，挑取單克隆培養(yǎng)提取質(zhì)粒，酶切鑒定后送至上海生工進(jìn)行測序。

1.6.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序獲得的序列利用BLAST和GenBank數(shù)據(jù)中序列進(jìn)行同源性分析。根據(jù)比對結(jié)果，在GenBank中檢索獲得標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rDNA序列，利用Mega 6.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(重復(fù)數(shù)為1000，步長值取百分比)。

1.6.3 生理生化鑒定

參照《細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]中的細(xì)菌鑒定方法，測定菌株各項(xiàng)生理生化項(xiàng)目，每項(xiàng)測試均設(shè)置對照。

1.7 拮抗菌的篩選

1.7.1 候選菌株分離

采集池塘水和底泥樣品，稱取10 g底泥和量取10 mL水樣加入90 mL的無菌水中，超凈工作臺中蝸旋振蕩搖勻，然后吸取上清液以10倍梯度稀釋法稀釋，取稀釋后的樣品各100 μL涂布于固體培養(yǎng)基平板，每個(gè)稀釋梯度涂布3個(gè)平板，最后將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，選擇合適菌落數(shù)的平板(30～300 cfu)，挑取單菌落進(jìn)行平板劃線純化，經(jīng)多次劃線純化后，得到純菌種，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 拮抗菌的初篩

將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌株AvX005菌液，取100 μL菌液均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基平板，等平板表面在超凈臺里面風(fēng)干后，用接種環(huán)挑取從池塘水和底泥中分離純化的菌株點(diǎn)種于涂布有菌株AvX005菌液平板培養(yǎng)基的表面。在30 ℃培養(yǎng)24 h后觀察點(diǎn)種菌落周圍是否產(chǎn)生抑菌圈。對周圍產(chǎn)生抑菌圈的菌落進(jìn)行分離純化，直至獲得對菌株AvX005具有拮抗作用的純培養(yǎng)物。

1.7.3 拮抗菌的復(fù)篩

將初篩的菌株接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃，165 r/min的搖床培養(yǎng)48 h，然后取其搖瓶中發(fā)酵液于離心機(jī)，13 000 r/min離心20 min，取其上清液10 μL滴于濾紙片上。將菌株AvX005活化后，取對數(shù)期100 μL菌液涂于LB固體瓊脂培養(yǎng)基表面，風(fēng)干后，用鑷子捏取含發(fā)酵液的濾紙片貼于平板瓊脂培養(yǎng)基的表面，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈的直徑。

1.8 拮抗成分理化性質(zhì)的研究及分離鑒定

1.8.1 生物活性測定

將培養(yǎng)48 h的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液(10 000 r/min離心20 min)取上清液分別經(jīng)溫度40、60、80、100 ℃處理1 h后，各取10 μL用于抑菌試驗(yàn)。蛋白酶K(20 mg/mL)處理1 h后，滅活蛋白酶K，各取10 μL用于抑菌試驗(yàn)。pH梯度 1、3、5、7、9、11、13處理1 h后調(diào)pH至中性，各取10 μL用于抑菌試驗(yàn)。

1.8.2 超高效液相色譜分離

取發(fā)酵48 h的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)發(fā)酵液100 mL，4 ℃，10 000 r/min離心20 min收集發(fā)酵上清液，用6 mol/L HCl調(diào)pH為2，冰箱4 ℃靜置12 h，然后10 000 r/min離心20 min收集沉淀，烘干，加入甲醇抽提，再加入少量無菌水用NaOH調(diào)為pH 7.0，10 000 r/min離心20 min，取上清液放置真空濃縮儀中冷凍干燥，2 mL 50%甲醇溶解，0.22 μm孔徑濾膜過濾，以進(jìn)樣量為10 μL進(jìn)行超高效液相色譜分離。所用柱子為ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm，5 μm)，所用儀器為Agilent 1290 Infinity。流動(dòng)相A1為ddH2O，B1為乙腈，流速0.5 mL/min，運(yùn)行方法見表1。0～20 min乙腈5%～100%，20～22 min乙腈100%，22～24 min乙腈100%～5%，24～25 min乙腈5%，檢測波長分別為235、250、275 nm。將收集到的組分在真空濃縮儀中凍干，除去乙腈，加入50%甲醇溶解，然后進(jìn)行抑菌活性檢測。

1.8.3 質(zhì)譜鑒定

在經(jīng)超高效液相色譜分離收集的樣品中添加0.1%的甲酸，進(jìn)樣20 μL于LTQ XL液質(zhì)聯(lián)用儀，所用柱子為C18柱，流動(dòng)相為10%～90%甲醇梯度，檢測波長為UV 235、250、275 nm，ESI離子源。噴霧壓力為35 psi，干燥氣(N2)流速為12 L/min，溫度為300 ℃。離子化電壓為4000 V，二級質(zhì)譜中氦氣為碰撞氣體，全掃描模式。

表1 色譜梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚患病癥狀

發(fā)病草魚表現(xiàn)為游動(dòng)緩慢、反應(yīng)遲鈍，體表發(fā)黑，胸鰭鰭條基部和局部魚體肌肉出現(xiàn)出血癥狀，肛門紅腫；剖檢可見體內(nèi)肝胰臟、脾臟、腎臟等有不同程度的腫脹，腸腔內(nèi)有淡黃色的腹水。

2.2 分離菌的形態(tài)特征

自患病草魚的鰓、肝、心、胰臟中分離到菌落形態(tài)一致、大小、顏色均一的優(yōu)勢菌(編號為AvX005)。該菌在37 ℃固體LB培養(yǎng)基中菌落見圖1，呈灰白色圓形，直徑約為2 mm。表面光滑、濕潤、中央隆起、邊緣整齊。(分離到的菌株AvX005經(jīng)冷場電子束掃描電鏡觀察，菌株呈短桿狀，兩端鈍圓，散落或聚集分布(圖2)。

圖1 AvX005菌株的菌落形態(tài)

圖2 AvX005菌株掃描電鏡觀察

2.3 回復(fù)感染試驗(yàn)測定

將分離菌株進(jìn)行回復(fù)感染試驗(yàn)，其結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果表明該菌株對草魚具有較強(qiáng)的致病性，其病癥與自然患病的癥狀相似。對照組注射0.85%無菌生理鹽水的草魚未出現(xiàn)死亡和發(fā)病病癥。取感染試驗(yàn)草魚病變組織進(jìn)行細(xì)菌分離，分離得到大量與原分離菌株形態(tài)及生理生化特性一致的菌株，表明所分離的菌株是此次魚病爆發(fā)的病原菌。

表2 回復(fù)感染試驗(yàn)結(jié)果

2.4 生理生化特征分析

菌株AvX005為革蘭氏陰性短小桿菌，具有運(yùn)動(dòng)性，V-P反應(yīng)和吲哚反應(yīng)為陽性，葡萄糖氧化發(fā)酵等部分生理生化指標(biāo)測定結(jié)果見表3。

表3 菌株AvX005的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性.

2.5 菌株AvX005的16S rDNA擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析

分離菌株的全基因組DNA提取凝膠電泳圖中條帶清晰(圖3)。該菌用16S rDNA的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得長度約為1500 bp的特異性條帶(圖4)。將16S rDNA擴(kuò)增測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析顯示，該菌與已知維氏氣單胞菌B7具有最高相似性，序列相似性達(dá)到99%。利用Mega 6.0的Kimura-2-Parameter模型，運(yùn)用鄰接構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5，顯示該菌與維氏氣單胞菌聚為一支，結(jié)合菌株的形態(tài)，16S rDNA序列分析(圖6)和生理生化表型特征，將該菌株AvX005命名為維氏氣單胞菌AvX005，該菌株16S rDNA序列在GenBank上獲得的登錄號為KU64116.1。

圖3 菌株AvX005的總DNA

圖4 菌株AvX005的16S rDNA擴(kuò)增 M: DL 5000 DNA Marker；1～2: 16S rDNA基因片段檢測.

圖5 根據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

Aeromonassp. mixed culture J7-6(氣單胞菌J7-6)；A.veroniiB565 strain B565(維氏氣單胞菌B565)；Aeromonassp. CSTL-6(氣單胞菌CSTL-6)；A.veroniistrain IQ105(維氏氣單胞菌IQ105)；A.veroniistrain E65(維氏氣單胞菌E65)；Aeromonassp. MK2(2010)(氣單胞菌MK2)；A.veroniistrain B7(維氏氣單胞菌B7)；A.veroniistrain X005(維氏氣單胞菌X005)；A.enteropelogenesstrain CECT4487(腸棕氣單胞菌CECT4487)；A.sanarelliistrain A2-67(圣雷利氣單胞菌AE122)；A.caviaestrain CECT 838(豚鼠氣單胞菌CECTCECT 838)；A.lacusstrain AE122(湖泊氣單胞菌AE122).

圖6 維氏氣單胞菌AvX005與維氏氣單胞菌 B7 的16S rDNA序列差異A:維氏氣單胞菌B7的16S rDNA序列；B:維氏氣單胞菌AvX005的16S rDNA序列.

2.6 拮抗菌篩選

2.6.1 菌株的初篩

自魚塘底泥和水樣中分離得到344株菌，采取點(diǎn)種法進(jìn)行篩選，得到10株產(chǎn)生較大透明圈的菌株。

2.6.2 菌株的復(fù)篩

通過對初步篩選得到的10株菌，進(jìn)行抑菌活性測定，得到5株較高產(chǎn)抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生菌，編號為Pa.1、BS、BS1、B1和B2，菌株活性測定見圖7，菌株BS抑菌活性最好，分子生物學(xué)方法鑒定為解淀粉芽孢桿菌，系統(tǒng)發(fā)育見圖8。生理生化特征為：革蘭氏染色呈陽性，能利用葡萄糖進(jìn)行氧化發(fā)酵，水解淀粉，明膠液化，蛋白胨水解，甲基紅和吲哚試驗(yàn)呈陰性，V-P試驗(yàn)呈陽性，這符合解淀粉芽孢桿菌的生理生化基本特征。

2.7 拮抗菌發(fā)酵液的理化性質(zhì)

解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液抑菌活性隨溫度的升高整體改變較大，低于80 ℃時(shí)保持較高活性，高于80 ℃時(shí)，活性降低較快；pH中性條件下抑菌活性最好，強(qiáng)酸環(huán)境中活性保持較好，強(qiáng)堿環(huán)境中幾乎失活；蛋白酶K處理后活性仍保持較好(表4)。

圖7 拮抗菌株的發(fā)酵上清液對維氏氣單胞菌的拮抗效果

圖8 根據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)，B. subtilis(枯草芽孢桿菌)，B. velezensis(貝萊斯芽孢桿菌)，B. methylotrophicus (甲基營養(yǎng)芽孢桿菌).

條件抑菌圈直徑/mm溫度40℃8．30±0．2060℃7．26±0．2580℃6．47±0．25100℃5．26±0．21pH17．26±0．1537．50±0．1057．50±0．1078．16±0．0597．36±0．15113．36±0．15132．10±0．10蛋白酶K6．33±0．21CK(發(fā)酵上清液)8．33±0．21

2.8 拮抗菌活性物質(zhì)分離

解淀粉芽孢桿菌抑菌活性產(chǎn)物分離見圖9，分別收集A1到A7洗脫峰，冷凍干燥后溶解于50%甲醇溶液，各取10 μL進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示A5洗脫峰對維氏氣單胞菌有明顯的拮抗效果(圖10)。修改UHPLC運(yùn)行方法，對A5洗脫峰在超高效液相色譜儀上進(jìn)一步分離，檢測波長為275 nm，得到洗脫峰B1、B2(圖11)，B1出峰時(shí)間為3.065 min，B2出峰時(shí)間為8.909 min，分別收集洗脫峰B1、B2，冷凍干燥后50%甲醇溶液溶解(濃縮10倍)，各取10 μL進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示，B2對維氏氣單胞菌有明顯的拮抗效果(圖12)。

圖9 解淀粉芽孢桿菌活性產(chǎn)物超高效液相色譜分離A1～A7：解淀粉芽孢桿菌活性產(chǎn)物洗脫峰被分成7組，并分別收集.

圖10 解淀粉芽孢桿菌粗提物色譜洗脫峰抑菌活性檢測A：維氏氣單胞菌拮抗試驗(yàn)，A1～A7：各洗脫峰；CK：解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液.

圖11 解淀粉芽孢桿菌抑菌活性物A5組分的超高效液相色譜分離B1～B7：解淀粉芽孢桿菌活性產(chǎn)物洗脫峰被分成2組，并分別收集.

圖12 解淀粉芽孢桿菌B1、B2洗脫峰活性檢測CK1：無菌水；CK2：50%甲醇溶液；B1，B2：濃縮10倍的洗脫峰；CK：濃縮10倍的解淀粉芽孢桿菌抑菌活性粗提物.

2.9 質(zhì)譜鑒定

超高效液相色譜儀上分離解淀粉芽孢桿菌活性峰B2，濃縮10倍，LTQ-XL質(zhì)譜儀對B2進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，該抑菌活性物質(zhì)荷為1045.29 [M-H]-(m/z)，可知其分子量為1045.29(圖13)。結(jié)合二級質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)B2離子峰所裂解出的碎片離子較多(圖14)，可推知B2化合物較穩(wěn)定。

圖13 解淀粉芽孢桿菌抑菌活性物質(zhì)B2一級質(zhì)譜圖

圖14 解淀粉芽孢桿菌抑菌活性物質(zhì)B2二級質(zhì)譜圖

3 討 論

3.1 病原菌分離與鑒定

維氏氣單胞菌屬弧菌科、氣單胞菌屬，1987年，Hickman-Brenner等[5]首次將此菌確定為該屬中的一個(gè)新種。該菌廣泛存在于淡水的河流、湖泊、池塘等多種水域環(huán)境，是一種致病性較強(qiáng)的人魚畜共患致病菌[6-7]，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人都具有一定的危害性。近年來國內(nèi)已報(bào)道可被維氏氣單胞菌感染的水產(chǎn)動(dòng)物包括黃鱔(Monopterusalbus)、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)、鰻鱺(Anguilla)、中華鱉(Trionyxsinensis)、羅非魚(Oreochromis)、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)、南方鲇(Silurusmeridionalis)稚魚、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)、胡子鲇(Clariasfuscus)等[8-16]，主要病癥為患病個(gè)體出血及腹水。本試驗(yàn)患病草魚除了上述癥狀外，還出現(xiàn)鱗片脫落和鰓絲呈灰白色等癥狀。維氏氣單胞菌可感染的水產(chǎn)動(dòng)物種類和發(fā)病范圍逐年擴(kuò)大，因此快速分離鑒定出病原菌是有效防治魚類疾病爆發(fā)的必要條件。水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚類細(xì)菌性病原的診斷方法有很多，主要包括生理生化特性鑒定技術(shù)(如API檢測試劑盒)[17]、免疫學(xué)診斷技術(shù)(如間接ELISA)[18]、分子生物學(xué)技術(shù)(如LAMP)[19]等。PCR檢測方法操作簡單、準(zhǔn)確、快速，可用于草魚病原維氏氣單胞菌的快速檢測。本研究從湖南望城喬口爆發(fā)病魚池病魚的病變組織分離到的一株優(yōu)勢菌，菌株16S rDNA全長1508 bp，在NCBI上經(jīng)BLAST分析，結(jié)果顯示，與維氏氣單胞菌B7具有最高相似性；不同的是菌株AvX005在第12、385、644、1504堿基位置上出現(xiàn)差異，分別為C、C、G、G，而維氏氣單胞菌B7分別為A、T、A、A，菌株AvX005在第1堿基位置上比維氏氣單胞菌B7多了一個(gè)A，結(jié)合生理生化特征鑒定等確定該菌株為維氏氣單胞菌(基因登錄號：KU64116.1)，命名為維氏氣單胞菌AvX005，經(jīng)回復(fù)感染試驗(yàn)顯示，該菌具有較強(qiáng)的致病性。試驗(yàn)魚發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀相似，從感染試驗(yàn)的患病草魚體內(nèi)分離獲得大量與原分離菌株形態(tài)及生理生化特性一致的菌株，確定所分離的維氏氣單胞菌是此次爆發(fā)性疾病的病原。已有研究表明，維氏氣單胞菌也是湖南省草魚疾病的主要病原菌之一[20]。

3.2 拮抗菌的篩選

拮抗菌的篩選通常采用體外試驗(yàn)方法，紙片法是常用的方法之一。指示菌為病原菌，指標(biāo)是待測菌能夠在瓊脂培養(yǎng)基上對指示菌產(chǎn)生抑制效果[21]。本試驗(yàn)以病原維氏氣單胞菌為指示菌，自養(yǎng)殖池塘底泥中篩選了一株活性較好的解淀粉芽孢桿菌，其抑菌直徑達(dá)8.3 mm。目前，國內(nèi)外關(guān)于水產(chǎn)病原性維氏氣單胞菌拮抗菌的篩選研究極少，國內(nèi)僅李聯(lián)泰等[22-23]對維氏氣單胞菌進(jìn)行了拮抗菌的篩選及對其拮抗物質(zhì)、生長條件做過相關(guān)研究。因此，本試驗(yàn)篩選到的拮抗菌進(jìn)一步豐富了維氏氣單胞菌的拮抗菌資源。利用拮抗微生物抑制水體中病原微生物的生長，使病原菌的密度低于其致病密度，進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的防治，是國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖病害控制的熱點(diǎn)[24]。解淀粉芽孢桿菌是一種對人畜相對安全的細(xì)菌，可作為候選益生菌有望在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到應(yīng)用。

3.3 抑菌活性物的初步研究

解淀粉芽孢桿菌作為重要的生防細(xì)菌，其抑菌活性范圍非常廣。如解淀粉芽孢桿菌R3[25]、Es-2[26]可以有效抑制致病性細(xì)菌，解淀粉芽孢桿菌SQR9[27]、PPCB004[28]可以有效抑制植物病原真菌。然而在水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的應(yīng)用研究中關(guān)于解淀粉芽孢桿菌拮抗魚類病原菌的抑菌活性產(chǎn)物的分離鑒定研究報(bào)道甚少。Nair等[29]通過營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基篩選到假單胞菌(Pseudomonas)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌(B.pumilus)對創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophilia)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈維弧菌(V.harveyi)、鰻弧菌(V.anguillarum)有明顯拮抗作用，然而沒有對其抑菌活性物進(jìn)行分離鑒定。本研究篩選的解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵上清液對維氏氣單胞菌具有拮抗作用，表明它能生產(chǎn)胞外抗細(xì)菌活性成分，將發(fā)酵上清液調(diào)至pH 2.0時(shí)，產(chǎn)生能抗菌的沉淀(上清液無抑菌活性)，沉淀經(jīng)甲醇溶解的溶液仍具有抑菌活性，表明可采用酸沉醇提方法提取抑菌活性物質(zhì)。酸沉醇提法[30]主要用于提取發(fā)酵上清液中的脂肽類物質(zhì)。眾多研究表明，解淀粉芽孢桿菌能夠產(chǎn)生伊枯草菌素、芬薺素和表面活性素的脂肽類抗生素，具有廣泛抑制真菌與細(xì)菌的能力[31]。本研究篩選到的解淀粉芽孢桿菌抑菌活性物的抑菌活性隨溫度的升高整體改變較大，低于80 ℃時(shí)保持較高活性，高于80 ℃時(shí)，活性降低較快；pH中性條件下抑菌活性最好，強(qiáng)酸環(huán)境中活性保持較好，強(qiáng)堿環(huán)境中幾乎失活；對蛋白酶不敏感。質(zhì)譜鑒定其活性物質(zhì)分子量為1045.29，這與已有研究報(bào)道解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類化合物理化性質(zhì)相似，化合物分子量接近。因此初步推測此抑菌活性物可能為一種脂肽類化合物，對其活性物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和確定及其對維氏氣單胞菌抑菌作用機(jī)理仍待進(jìn)一步研究。

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