苜蓿素對脂多糖誘導(dǎo)下奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥和乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

占今舜，詹 康，陳小連，霍俊宏，趙國琦

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200； 2.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

苜蓿素(Tricin)為4′，5，7-三羥基- 3′，5′-二甲氧基黃酮，是一種黃酮類化合物。苜蓿素是在感染銹病的小麥(Triticumaestivum)葉5片中首次發(fā)現(xiàn)的，之后在苜蓿(Medicagosativa)等牧草和水稻(Oryzasativa)、高粱(Sorghumbicolor)和大麥(Hordeumvulgare)等谷物植物中發(fā)現(xiàn)[1]。據(jù)報道，苜蓿素能夠幫助植物抵御細(xì)菌和真菌的侵襲，并抑制野草生長，因此，可以將其開發(fā)為一種除草劑[2]。Bichoff等[3]研究發(fā)現(xiàn)，從苜蓿中提取的苜蓿素能夠使腸道組織平滑肌松弛，具有輕微的雌激素活性和發(fā)揮抗氧化作用。Verschoyle等[4]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿素有抗小鼠胃腸道癌變的作用，被認(rèn)為可以開發(fā)成一種臨床抗癌癥的藥物。另外，苜蓿素還有抗病毒、抗結(jié)核和免疫調(diào)節(jié)活性等作用[5-7]。我國燕麥(Avenasativa)、苜蓿等植物的種植規(guī)模逐漸擴(kuò)大[8-9]，提取苜蓿素的原料來源逐漸豐富。

乳腺上皮細(xì)胞是合成和分泌乳汁的主要場所，當(dāng)其被金黃葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌等細(xì)菌感染后，會產(chǎn)生乳房炎，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)下降。而脂多糖(LPS)是大腸桿菌等革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的一種成分，進(jìn)入體內(nèi)引起組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，因此可導(dǎo)致乳腺組織損傷[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在 LPS刺激下，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中炎癥因子(TNF-α和IL-1β)的表達(dá)上調(diào)，抗氧化酶活性降低，丙二醛(MDA)含量升高，細(xì)胞膜滲透性升高，促使細(xì)胞凋亡加快[11-13]。另外，LPS能夠下調(diào)乳腺上皮細(xì)胞脂肪酸攝取、活化與轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因表達(dá)，從而抑制乳脂合成，能夠通過影響mTOR 和JAK2-STAT5 等細(xì)胞內(nèi)信號途徑抑制乳蛋白的合成[14-15]。以上研究結(jié)果說明，LPS能夠?qū)е履膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞受損，對乳成分的合成具有一定的影響。苜蓿素具有抗氧化和免疫應(yīng)激等作用，而LPS能夠引起奶牛乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥和影響乳品質(zhì)，因此，本研究分析苜蓿素對脂多糖刺激下體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥因子和乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期了解苜蓿素是否能夠通過發(fā)揮抗炎癥作用來改善乳蛋白的合成。

1 材料與方法

1.1 材料

苜蓿素(≥98%，色譜純)，從燕麥中提取，購于上海源葉生物科技有限公司；脂多糖(LPS，血清型O55:B5)購于美國Sigma公司；試驗所用奶牛乳腺上皮細(xì)胞與占今舜等[16]相同。

1.2 試驗方法

1.2.1細(xì)胞活性檢測 試驗于2016年9月開始進(jìn)行，試驗分為4組，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基(對照組)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1的LPS(L)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1的LPS和10 μg·mL-1苜蓿素(L+T)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 μg·mL-1苜蓿素(T)，每組5個重復(fù)，其中苜蓿素用二甲基亞砜(DMSO)(索萊寶，北京)完全溶解，4個處理組中的DMSO含量低于2‰。細(xì)胞活性采用CCK-8法進(jìn)行檢測，試驗方法參照Matsui等[17]。

1.2.2抗氧化指標(biāo)的測定 取密度為5×105個·mL-1細(xì)胞接種到六孔板，方法同上。一氧化氮(NO)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)等指標(biāo)的測定方法參照占今舜等[16]。

1.2.3細(xì)胞總RNA的提取和RT-PCR條件 取密度為5×105mL-1細(xì)胞接種到6孔板，方法同上。試驗結(jié)束時，進(jìn)行RNA提取和cDNA的合成。提取和合成方法參照占今舜等[18]。RT-PCR試劑盒由Roche公司提供，PCR反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行，反應(yīng)液包括Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，PCR級水3 μL，cDNA 5 μL。將配制的反應(yīng)液加入96孔反應(yīng)板(Roche公司提供)中，在Light Cycler?96 PCR儀(Roche公司)上進(jìn)行PCR檢測。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性600 s；PCR反應(yīng)為95 ℃、10 s，退火60 ℃和72 ℃延伸各10 s，循環(huán)45次；融解曲線分析65 ℃、60 s。

1.2.4引物設(shè)計 根據(jù)Gene Bank中的基因序列，引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件完成，引物合成則由Invitrogen公司完成。引物序列如表1和2所列。

表1 炎癥因子相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primer sequences for inflammatory genes

表2 乳蛋白合成相關(guān)基因的引物序列Table 2 Primer sequences for lacto-protein genes

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)先用Excle 2007進(jìn)行預(yù)處理，基因表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計算。數(shù)據(jù)采用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)表示，并在IBM SPSS Statistics 21.0軟件上進(jìn)行ANOVA分析，LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿素對乳腺上皮細(xì)胞活性的影響

結(jié)果表明，苜蓿素具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。只加入苜蓿素的T組的奶牛乳腺上皮細(xì)胞相對活性顯著高于其他各組(P<0.01)；奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性在脂多糖(L)刺激下顯著降低(P<0.05)，而添加苜蓿素(L+T)較脂多糖處理能夠顯著提高細(xì)胞活性(P<0.05)(圖1)。

2.2 苜蓿素對乳腺上皮細(xì)胞抗氧化性能的影響

在LPS刺激下，乳腺上皮細(xì)胞LDH活性和NO、MDA含量極顯著升高(P<0.01)，SOD活性極顯著降低(P<0.01)；而添加苜蓿素后，NO和MDA含量較L處理顯著降低(P<0.01)，SOD活性顯著升高(P<0.01)(表3)。

2.3 苜蓿素對乳腺上皮細(xì)胞炎癥因子相關(guān)基因的影響

與對照組相比，添加苜蓿素能夠極顯著升高細(xì)胞MyD88的表達(dá)(P<0.01)(表4)。在LPS刺激下，細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR2、TLR4和MyD88的表達(dá)均顯著升高(P<0.01)，而較LPS處理添加苜蓿素能夠顯著降低IL-1β、TNF-α、TLR2和TLR4的表達(dá)(P<0.01)。以上結(jié)果表明，苜蓿素能夠抑制LPS誘導(dǎo)下細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生。

圖1 苜蓿素對脂多糖刺激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞活性的影響 Fig. 1 Effect of tricin on viability of LPS-induced BMECs

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Control，對照，表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基，L表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1LPS，L+T表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1LPS+10 μg·mL-1苜蓿素，T表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 μg·mL-1苜蓿素，下同。

Different lowercase and capital letters indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively, and the same letter indicate no significant difference at the 0.05 level. Control, basic medium; L, basic medium with 1 μg·mL-1LPS; L+T, basic medium with 1 μg·mL-1LPS+10 μg·mL-1tricin; T, basic medium with 10 μg·mL-1tricin; similarly for the following tables.

表3 苜蓿素對脂多糖刺激下乳腺上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響Table 3 Effect of tricin on antioxidant indices of mammary epithelial cells treated with LPS

同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。Control,對照,表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基，L表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1LPS，L+T表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1 μg·mL-1LPS+10 μg·mL-1苜蓿素，T表示基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10 μg·mL-1苜蓿素。表4、表5同。

Different lowercase and capital letters indicate significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively, and the same letter indicate no significant difference at the 0.05 level. Control, basic medium; L, basic medium with 1 μg·mL-1LPS; L+T, basic medium with 1 μg·mL-1LPS+10 μg·mL-1tricin; T, basic medium with 10 μg·mL-1tricin; this also applies to Table 4 and Table 5.

2.4 苜蓿素對乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)信號通路及乳成分合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

無LPS刺激下，添加苜蓿素能夠極顯著提高細(xì)胞JAK2、STAT5、mTOR、4EBP1和S6K1的表達(dá)量(P<0.01)，但降低了CAT1的表達(dá)(P<0.01),LAT1無明顯變化(表5)。在LPS刺激下，細(xì)胞CAT1、LAT1、STAT5、mTOR和4EBP1的表達(dá)顯著降低(P<0.01或P<0.05)，而添加苜蓿素能夠顯著升高STAT5的表達(dá)(P<0.01)和降低CAT1的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果說明，添加苜蓿素能夠促進(jìn)乳蛋白的合成；LPS刺激下，乳蛋白合成受阻，而添加苜蓿素對乳蛋白合成影響不明顯。

表4 苜蓿素對脂多糖刺激下乳腺上皮細(xì)胞炎癥因子基因表達(dá)的影響Table 4 Effect of tricin on inflammatory gene expression of mammary epithelial cells treated with LPS

表5 苜蓿素對脂多糖刺激下乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)信號通路及乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響Table 5 Effect of tricin on signal path and lactoprotein synthesis of mammary epithelial cells treated with LPS

3 討論

3.1 苜蓿素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗炎的影響

一般情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡。體內(nèi)產(chǎn)生的自由基過多，會導(dǎo)致細(xì)胞中的不飽和脂肪酸產(chǎn)生MDA，進(jìn)而致使細(xì)胞解體，促使細(xì)胞死亡[19]。Shi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠?qū)е履膛Ｈ橄偕掀ぜ?xì)胞的GSH-Px、SOD和CAT活性降低，而MDA含量升高。劉立新等[20]和王亨等[21]研究發(fā)現(xiàn)，LPS能夠抑制奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。而本研究也發(fā)現(xiàn)，LPS降低細(xì)胞的成活率和抗氧化能力。以上結(jié)果說明，脂多糖可能會增加細(xì)胞內(nèi)自由基，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，添加適量的苜蓿黃酮、大豆黃酮和染料木黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的活性和SOD活性，降低MDA的含量[22-23]。說明黃酮類物質(zhì)可以通過提高細(xì)胞的抗氧化能力，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。從本研究結(jié)果看，苜蓿素能夠發(fā)揮抗氧作用，抑制LPS誘導(dǎo)下細(xì)胞的增殖。

LDH是糖酵解過程中的一種氧化還原類酶，能夠催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)。只有當(dāng)細(xì)胞受到損傷時，LDH活性會升高。研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿黃酮能夠降低熱應(yīng)激下奶牛乳腺上皮細(xì)胞的LDH的活性[16]；二羥異黃酮和三羥異黃酮能夠降低過氧化氫誘導(dǎo)的中國倉鼠卵巢細(xì)胞的 LDH釋放量[24]。結(jié)果說明，黃酮類化合物能夠降低LDH的活性。本研究結(jié)果與上述研究相似，說明LPS能夠造成細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞LDH活性升高，而添加苜蓿素能夠降低LDH活性，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免受損傷。LPS是一種重要的炎癥反應(yīng)因子，能夠誘導(dǎo)TNF-ɑ、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)。NO是細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的重要信號分子，具有調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞正常功能等作用，且在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞和組織發(fā)生炎癥時，會促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮酶(iNOS)的表達(dá)，使NO含量升高，進(jìn)而激活環(huán)氧化酶2(COX-2)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25-26]。Jung等[27]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿素能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB和STAT3下調(diào)iNOS和COX-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制LPS誘導(dǎo)下RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)的NO和ROS含量。Shalini等[28-30]研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿素能夠顯著下調(diào)LPS刺激下人外周血單核細(xì)胞(hPBMCs)TNF-α、IL-6、PGE2 和 NO的生成，抑制 TLR4、MyD88 和TRIF 蛋白的活性；通過調(diào)節(jié)MAPK和PI3K/Akt 通路，下調(diào)NF-κB信號，降低COX-2 和TNF-α，提高人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎癥作用。另外，苜蓿素能夠顯著降低哮喘小鼠TNF-α、IL-1β和 NO水平，顯著降低肺泡巨噬細(xì)胞的TLR4、MyD88 和NF-κBp65mRNA和蛋白相對表達(dá)量[31]。本研究也發(fā)現(xiàn)，苜蓿素能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)性奶牛乳腺上皮細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β、TLR4、TLR2的表達(dá)和 NO水平，說明苜蓿素發(fā)揮抗炎癥作用與其調(diào)控TRL4/MyD88/NF-κB 通路有關(guān)。

3.2 苜蓿素對乳蛋白合成的影響

乳蛋白是血液中游離氨基酸在乳腺上皮細(xì)胞中合成，而氨基酸進(jìn)入細(xì)胞需要氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的參與。堿性氨基酸主要由氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體CAT1進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，而支鏈氨基酸、中性氨基酸和一些必需氨基酸則由LAT1轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，這兩種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)的高低能夠影響乳蛋白的合成。從本研究來看，在LPS刺激下，無論是否添加苜蓿素，均抑制氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)。將小鼠的JAK2和STAT5基因敲除，發(fā)現(xiàn)小鼠的乳腺腺泡發(fā)育不良，乳蛋白含量降低，酪氨酸磷酸化作用降低。激活的mTOR能夠抑制4EBP1發(fā)生磷酸化，促使eIF4E釋放4EBP1，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯。mTOR還能夠促進(jìn)S6K1磷酸化，增強(qiáng)含嘧啶基因mRNA的翻譯，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成[18,32]。因此，乳蛋白的合成受到JAK2-STAT5和mTOR信號通路的調(diào)控。劉立新等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在LPS(>1 μg·mL-1)刺激下，奶牛乳腺上皮細(xì)胞的mTOR、S6K1、4EBP1 和STAT5 mRNA轉(zhuǎn)錄和相關(guān)蛋白的表達(dá)降低。本研究結(jié)果與其相似。然而張養(yǎng)東[14]發(fā)現(xiàn)，在LPS(0.1～1 ng·mL-1)刺激下，奶牛乳腺上皮細(xì)胞S6K1和4EBP1 mRNA的表達(dá)提高(P>0.05)，STAT5 mRNA 表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)，而mTOR和JAK2 mRNA 的表達(dá)水平無變化。結(jié)果有所不同，可能是LPS添加劑量不同所致。在本研究中，在LPS刺激下，添加苜蓿素對mTOR、JAK2、S6K1和4EBP1的表達(dá)無顯著影響；而無LPS刺激下，添加苜蓿素能顯著上調(diào)mTOR、JAK2、STAT5、S6K1和4EBP1的表達(dá)。結(jié)果說明，苜蓿素可能會通過調(diào)控JAK2-STAT5和mTOR信號通路來促進(jìn)乳蛋白的合成；LPS刺激下，乳蛋白合成會受阻，而添加苜蓿素對其影響不大。

4 結(jié)論

1)苜蓿素能夠提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力，促進(jìn)細(xì)胞的增殖；可能通過調(diào)控TRL4/MyD88/NF-κB 通路，降低炎癥因子的表達(dá)和NO的生成，進(jìn)而發(fā)揮抗炎癥作用。

2)LPS通過調(diào)控JAK2-STAT5和mTOR信號通路來抑制乳蛋白合成，而苜蓿素可能通過調(diào)控JAK2-STAT5和mTOR信號通路來促進(jìn)乳蛋白的合成。

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