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    小鼠肝炎病毒抗體ELISA和IFA檢測試劑盒真實性評價

    2018-03-09 05:54:30張志妮郭中敏
    中國動物檢疫 2018年3期
    關(guān)鍵詞:試劑盒陰性陽性

    張志妮,郭中敏,嚴(yán) 楚

    (1. 中山大學(xué),廣東廣州 510006;2. 廣州市白云區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所鐘落潭鎮(zhèn)分所,廣東廣州 510550)

    小鼠肝炎病毒((Mouse hepatitis virus,MHV)是一種高傳染性,可造成小鼠肝炎并在小鼠群中劇烈暴發(fā)并遍及全球的病毒[1],屬日冕冠狀病毒科冠狀病毒屬,有囊膜,線性不分段的單股正鏈RNA病毒[1-2],主要經(jīng)過空氣和接觸傳播。在自然界中,小鼠是其唯一易感動物。該病毒多數(shù)情況下引起亞臨床感染或慢性感染,應(yīng)激或機體抵抗力下降時可引起急性發(fā)病和死亡,是對實驗小鼠危害最為嚴(yán)重的病毒之一[2]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物 小鼠肝炎病毒檢測方法》(GB/T 14926.22—2001)規(guī)定的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immune-sorbent assay,ELISA)、間接免疫熒光抗體試驗(Immunofluorescence assay,IFA)和免疫酶試驗(Immunoenzyme assay,IEA)。如ELISA檢測為陽性的樣品,經(jīng)IFA檢測仍為陽性,方可判為陽性結(jié)果。本研究分析了26份小鼠血清樣本的ELISA、IFA檢測結(jié)果,初步評價了兩種方法的真實性,為實驗動物房MHV日常監(jiān)測提供了借鑒。

    1 材料與方法。

    1.1 材料

    MHV ELISA Kit:購自EBI-xpress Biotech International;小鼠肝炎病毒免疫熒光(IFA)試劑盒:購自蘇州西山生物技術(shù)有限公司;待測樣品:近2年來自不同屏障設(shè)施的26份SPF級小鼠血清。

    1.2 主要儀器

    多功能酶標(biāo)儀:Multiskan Ascent,美國Thermo。智能型生物顯微鏡:LEICA DM5000B,德國Leica。恒溫振蕩儀:ZD-85,中國金壇富華。

    1.3 檢測方法

    1.3.1ELISA試劑盒 檢測過程依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。將26份待測樣品按1∶50的體積比稀釋(待檢血清∶樣本稀釋液=10∶490),對結(jié)果使用Multiskan Ascent多功能酶標(biāo)儀于405 nm波長讀值。陰性對照血清、陽性對照血清均為試劑盒自帶。

    1.3.2IFA試劑盒檢測 檢測過程依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。將26份待測樣品按1∶25的體積比稀釋(待檢血清∶樣本稀釋液=5∶120),使用LEICA DM5000B智能型生物顯微鏡對結(jié)果進(jìn)行判讀。陰性對照血清、陽性對照血清均為試劑盒自帶。鏡下判讀標(biāo)準(zhǔn):僅有紅色細(xì)胞背景為“?”,僅見黃綠色熒光為“+”,可見明亮的綠色與黃色熒光為“++”,耀眼的綠色與黃色熒光為“+++”。

    1.3.3檢測效果初步評價 根據(jù)檢測結(jié)果,首先制作四格表(表1),再根據(jù)表格數(shù)據(jù)計算相應(yīng)指標(biāo)。靈敏度=a/(a+c)×100%,特異度=d/(b+d)×100%,誤診率=b/(b+d)×100%,漏診率=c/(a+c)×100%,粗一致率,即準(zhǔn)確度=(a+d)/(a+b+c+d)×100%,約登指數(shù),即正確指數(shù)=[a/(a+c)+d/(b+d)]–1,陽性似然比=[a/(a+c)]/[b/(b+d)]×100%,陰性似然比=[c/(a+c)]/[d/(b+d)]×100%[3]。

    表1 ELISA、IFA檢測結(jié)果統(tǒng)計

    2 結(jié)果

    2.1 ELISA檢測

    2.1.1結(jié)果有效性判定 陰性對照血清的陽性病毒抗原孔讀數(shù)減去陰性對照抗原孔讀數(shù)必須<0.250,陽性對照血清的陽性病毒抗原孔讀數(shù)減去陰性對照抗原孔讀數(shù)必須>0.600,否則需重新檢測。本試驗試劑盒自帶陰性對照血清ΔOD為0.012,陽性對照血清ΔOD為2.883,證實有效(表2)。

    2.1.2待測樣本結(jié)果判定 ΔOD=抗原孔讀數(shù)OD值?對照抗原孔OD值,ΔOD≥0.300,結(jié)果判為陽性(P),ΔOD<0.300,結(jié)果判為陰性(N)。26份血清中,有15份陽性、11份陰性(表2)。

    2.2 IFA檢測

    2.2.1結(jié)果有效性判定 陰性對照血清的陽性感染細(xì)胞孔和陰性對照細(xì)胞孔均為“?”,陽性對照血清的陽性感染細(xì)胞孔判讀為“+~+++”,陰性對照細(xì)胞孔為“?”則本次試驗有效,否則需重新檢測。本試驗試劑盒自帶陰性對照血清陽性感染細(xì)胞孔和陰性對照細(xì)胞孔均為“?”,陽性對照血清的陽性感染細(xì)胞孔判讀為“++”,陰性對照細(xì)胞孔為“?”,證實有效(表2)。

    2.2.2樣本結(jié)果判定 26份血清中,有13份顯示陽性,其中5份為“+”,8份為“++”,剩余13份血清結(jié)果顯示陰性(表2)。

    2.3 ELISA和IFA檢測結(jié)果真實性評價

    26份血清中,有13份均被ELISA和IFA檢測均為陽性、11份均為陰性,另2份分別為ELISA檢測陽性、IFA檢測陰性。根據(jù)表3統(tǒng)計結(jié)果,參比IFA,ELISA檢測試劑盒的真實性指標(biāo)為:靈敏度100%,特異度84.61%,誤診率15.38%,漏診率0,準(zhǔn)確度92.3%,正確指數(shù)0.846,陽性似然比650%,陰性似然比0。

    表2 樣品的ELISA、IFA檢測結(jié)果

    表3 ELISA、IFA檢測結(jié)果統(tǒng)計 單位:份

    3 討論

    MHV是我國清潔級或以上級別實驗小鼠應(yīng)排除的病原之一,是國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測》(GB 14922.2—2011)規(guī)定的必檢項目,2013年首次被納入新版《中華人民共和國進(jìn)境動物檢疫疫病名錄》。

    1949年Cheever首次在后肢癱瘓小鼠腦中首次分離到MHV-JHM 株,隨后鑒定出其他毒株。我國1979年于裸鼠中發(fā)現(xiàn)并分離到該病毒[4]。近年來的血清流行病學(xué)調(diào)查顯示,2004—2007年我國臺灣地區(qū)的MHV陽性率為3.4%~12%[5],2000—2003年歐洲為12%,北美為1.59%[6];2003—2007年我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的檢出率為3%~7%[7],湖南省疾病預(yù)防控制中心在湖南省醫(yī)藥科研單位和藥廠飼養(yǎng)動物中的陽性檢出率為2.7%~6.8%[8],廣東省實驗動物監(jiān)測所在廣東省6個屏障設(shè)施中的陽性檢出率為2%~13.7%[6];2011年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所在11家繁殖區(qū)域送檢的動物中均檢出陽性[9];北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司在2012—2013年國內(nèi)送檢小鼠中的陽性檢出率高達(dá)19.9%[10];2015年在廣東省舉辦的實驗動物質(zhì)量檢測交流會上,北京、上海和廣東監(jiān)督檢驗站報告在近5年來的檢測工作中均有陽性被檢出。雖然不同時間、不同單位的監(jiān)測結(jié)果不盡相同,但不難發(fā)現(xiàn),MHV感染情況較為普遍,抗體陽性率較高。因此,對于MHV污染的防控,日常監(jiān)控尤為重要。

    研究發(fā)現(xiàn),小鼠人工感染MHV后,抗體產(chǎn)生周期短,持續(xù)時間長,5~7 d 內(nèi)IgG明顯升高,3周時達(dá)到高峰,維持到28 d后開始緩慢下降;而IgM水平上升時間更早,3 d開始升高,7 d達(dá)高峰,3周后開始下降[11]。而更換“臟墊料”法自然感染的ICR小鼠陽性抗體持續(xù)至84 d未見明顯降低;在接觸病原2 d內(nèi),在肺臟中檢出病毒陽性,隨后在其他組織樣本均檢出陽性,14 d后,病毒檢出率開始下降,84 d后所有組織樣本中均未檢出病毒[12]。可見,抗原可作為早期檢測的輔助手段,而抗體檢測具有較高穩(wěn)定性,適用于MHV日常監(jiān)控,同時IgM亦可考慮用于早期感染的血清學(xué)檢測。

    靈敏度高是ELISA、IFA的優(yōu)點。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926.22—2001規(guī)定,MHV檢測方法為ELISA、IFA和IEA。鑒于IEA法抗原不易制備,而ELISA、IFA均有商品化檢測試劑盒,故對于日常大量樣本的MHV快速檢測,目前國內(nèi)檢測單位一般采用ELISA 初篩,陽性樣本用IFA進(jìn)行復(fù)檢。因此,選擇適合的ELISA、IFA檢測試劑盒尤為關(guān)鍵。

    前期預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn),國產(chǎn)ELISA試劑盒檢測結(jié)果差強人意,故選擇了進(jìn)口試劑盒。13份檢測均為陽性的結(jié)果中,ELISA檢測數(shù)值大小與IFA不一致,估計為兩種檢測試劑盒包被的抗原不一致所致。

    4 結(jié)論

    本次試驗初步評價了ELISA和IFA兩種進(jìn)口試劑盒,反觀兩者符合度高。ELISA檢出率略高,有2份樣品ELISA檢測為陽性,但I(xiàn)FA檢測卻為陰性,進(jìn)一步證實了初篩使用ELISA方法的必要性;參比,IFA,ELISA試劑盒的靈敏度為100%,特異度為84.61%,準(zhǔn)確度為92.3%,正確指數(shù)為0.846,數(shù)據(jù)客觀真實,初步證實ELISA試劑盒配合IFA適用于動物房MHV抗體的日常監(jiān)測。但仍需擴大樣本量對該檢測方法的真實性進(jìn)行數(shù)據(jù)補充和修正,同時需應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行可靠性指標(biāo)檢測。只有這樣,才能較為客觀、真實地反應(yīng)檢測區(qū)域的MHV感染率。

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