15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記副溶血弧菌的培養(yǎng)基制備與培育

趙麗青，王 勇，黃小華，張曉良，劉恩德，胡 煒，孫 宇，吳振興，賈俊濤，李正義

（1.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東青島 266002；2.貴州出入境檢驗(yàn)檢疫局，貴州貴陽(yáng) 550000）

弧菌是海洋環(huán)境中最常見(jiàn)的細(xì)菌類型，維持著 正常的海洋生態(tài)環(huán)境。但有些弧菌對(duì)人類和海洋動(dòng)物有害。1995年《美國(guó)臨床微生物手冊(cè)》（第六版）確定了弧菌中的致病菌有12種，其中最重要的是霍亂弧菌、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和創(chuàng)傷弧菌[1]。在烹飪不當(dāng)或食物容器生熟不分時(shí)，致病性弧菌可引起胃腸炎、創(chuàng)傷感染和食物中毒等癥狀[2]，因此美國(guó)食品藥品管理局（FDA）、北歐食品分析委員會(huì)（NMKL）和我國(guó)衛(wèi)生部都制定了相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[3]。

近年來(lái)，副溶血弧菌引起的食物中毒比例較高，已成為沿海地區(qū)食物中毒的首要病原，其危害程度僅次于沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌[4]。副溶血弧菌的致病因子有溶血素、脂多糖、胞外蛋白酶、尿素酶及Ⅲ型分泌系統(tǒng)等[5-6]。在多種環(huán)境刺激下，如低溫（冷鏈?zhǔn)称罚⒏啕}（腌漬食品）、高溫、酸和堿等，副溶血弧菌處于損傷狀態(tài)，致病性會(huì)發(fā)生變化。如何有效監(jiān)測(cè)受損的致病性弧菌，尤其是副溶血弧菌在多種環(huán)境中的殘存狀態(tài)，以及評(píng)估消費(fèi)者最終暴露于副溶血弧菌等致病菌的可能性，具有重要的指導(dǎo)意義。

穩(wěn)定同位素標(biāo)記（Stable isotope probing，SIP）技術(shù)具有示蹤、指示和判斷的功能，其檢測(cè)快速，結(jié)果準(zhǔn)確，是了解致病菌受損過(guò)程中蛋白質(zhì)和核酸動(dòng)態(tài)變化的重要手段之一[7]。SIP技術(shù)主要包括兩種不同的路線：一種稱為代謝標(biāo)記法，是以同位素標(biāo)記的氨基酸形式在培養(yǎng)時(shí)加入；另一種稱為化學(xué)標(biāo)記法，是在蛋白質(zhì)提取后，酶解前、中、后蛋白質(zhì)的一些功能基團(tuán)與含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。前者一般采用含有重穩(wěn)定同位素型必須氨基酸的培養(yǎng)基對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)，但是無(wú)論是采用微生物發(fā)酵法，還是有機(jī)化學(xué)合成穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸的方法，其成本高，工藝復(fù)雜，相關(guān)報(bào)道較少；后者采用蛋白質(zhì)提取，使蛋白質(zhì)功能基團(tuán)（如肽段）與穩(wěn)定同位素標(biāo)記的試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，雖然應(yīng)用廣泛，但副反應(yīng)多，工藝復(fù)雜[8-9]。

本文提供了一種15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記副溶血弧菌培養(yǎng)基的方法。副溶血弧菌通過(guò)標(biāo)記培養(yǎng)基進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，將菌細(xì)胞中氮原子置換成穩(wěn)定同位素15N，再通過(guò)質(zhì)譜法LC-MS/MS進(jìn)行驗(yàn)證。在富含15N的培養(yǎng)介質(zhì)中，生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)被標(biāo)記。培養(yǎng)結(jié)束后，將正常介質(zhì)（14N）中生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞和被15N標(biāo)記的細(xì)胞混合，破碎細(xì)胞，通過(guò)選擇性親和分離、色譜分離等過(guò)程，提取相關(guān)蛋白質(zhì)，進(jìn)行消化酶解，使其成為肽段，最后進(jìn)行質(zhì)譜分析。來(lái)自兩個(gè)對(duì)比樣本的每一肽段在質(zhì)譜圖中表現(xiàn)為對(duì)峰，峰的間距等于標(biāo)記肽段中的15N原子數(shù)。通過(guò)比較質(zhì)譜圖中同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物的對(duì)峰強(qiáng)度，便可確定對(duì)照細(xì)胞體系中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異。由于兩個(gè)對(duì)比樣本測(cè)定是在同一分析過(guò)程下完成的，因此具有很高的準(zhǔn)確性；同時(shí)內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜法的信噪比高，測(cè)定靈敏度也較高。在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究中，質(zhì)譜只能應(yīng)用于蛋白質(zhì)的鑒定，而不能用于定量分析。這是因?yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)或多肽具有不同的離子化率，而用同位素標(biāo)記差異質(zhì)譜巧妙地解決了這個(gè)問(wèn)題[10]，從而為以后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株

副溶血弧菌ATCC17802，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。

1.2 儀器和試劑

儀器：液相色譜系統(tǒng)（Thermo Scientific EasynLC 1000）， 質(zhì) 譜 儀（Thermo Fisher Orbitrap Velos）。試劑：蛋白胨10 g/L，氯化鈉30 g/L，蒸餾水1 L，NH4Cl 2 g/L，葡萄糖10 g/L，KH2PO40.6 g/L，KH2PO40.9 g/L，MgSO40.2 g/L，NaCl 20 g/L。

1.3 副溶血弧菌15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記最優(yōu)培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基成分對(duì)副溶血弧菌的生長(zhǎng)有顯著影響。不同成分及各成分的用量和配比，不僅影響副溶血弧菌的產(chǎn)量和質(zhì)量，而且也是決定生產(chǎn)成本的關(guān)鍵因素。堿性蛋白胨水是培養(yǎng)弧菌的通用配方，但是蛋白胨為有機(jī)氮源，無(wú)法進(jìn)行15N標(biāo)記。優(yōu)化15N-副溶血弧菌培養(yǎng)基的制備，以15N-副溶血弧菌產(chǎn)量高、15N的投入成本低為原則。本研究在國(guó)標(biāo)GB4789.7的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)方法來(lái)優(yōu)化碳源和氮源的用量和比例。

選擇（NH4）2SO4、NH4Cl和尿素作為無(wú)機(jī)氮源，葡萄糖和乙酸鈉為碳源，其他培養(yǎng)基成分（KH2PO4、K2HPO4、MgSO4和NaCl）固定，設(shè)計(jì)了“五因素、四水平”正交試驗(yàn)方案。

1.4 副溶血弧菌在15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記培養(yǎng)基上的培育

將副溶血弧菌ATCC17802接種到3%氯化鈉堿性蛋白胨水中進(jìn)行第1次增菌，于36 ℃搖床條件下培養(yǎng)18 h；用接種環(huán)將第1次增菌的副溶血弧菌轉(zhuǎn)接10環(huán)到15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記培養(yǎng)基上，于36 ℃搖床條件下培養(yǎng)40 h；用接種環(huán)將第2次增菌的副溶血弧菌轉(zhuǎn)接3環(huán)到15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記培養(yǎng)基中，進(jìn)行第3次增菌，于36 ℃搖床條件下培養(yǎng)36 h；用接種環(huán)將第3次中增菌的副溶血弧菌轉(zhuǎn)接2環(huán)到15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記培養(yǎng)基中進(jìn)行第4次增菌，于36 ℃搖床條件下培養(yǎng)24 h。待上述培養(yǎng)達(dá)到所需菌量后，10 000 r/min離心5～10 min，收集第4次增菌的副溶血弧菌細(xì)胞。

使用15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記培養(yǎng)基，連續(xù)多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)副溶血弧菌。進(jìn)行高豐度15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記副溶血弧菌的逐步富集培養(yǎng)，馴化出高豐度15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記副溶血弧菌。

1.5 蛋白提取

將收集的15N標(biāo)記副溶血弧菌和堿性蛋白胨水培養(yǎng)的副溶血弧菌提白分別用PBS清洗1次，然后加入200 μL 8 mol/L尿素和蛋白酶抑制劑，冰浴超聲（3 s、3 s、1 min、25%）。4 ℃、10 000 g離心10 min，去沉淀；使用Bradford法對(duì)蛋白進(jìn)行定量；將總蛋白定量后取5 μg，將其還原烷基化后加入胰蛋白酶酶解。

1.6 副溶血弧菌細(xì)胞中蛋白質(zhì)氮原子標(biāo)記效率的LC-MS/MS驗(yàn)證

1.6.1操作 將酶解液10 000 r/min、4 ℃離心后取上清液，ZipTip脫鹽，經(jīng)離心濃縮儀干燥后，用0.1%甲酸溶液復(fù)溶，高速離心后取上清液注入LC-MS/MS儀器分析。

1.6.2質(zhì)譜條件 取制備好的樣品5 μL進(jìn)行上樣，設(shè)備為Thermo Fisher Orbitrap Velos。反向高效液相色譜條件（流動(dòng)相）為A：0.1% Formic acid in water，B：0.1% Formic acid in Acetonitrile；流速為400 nL/min。質(zhì)譜檢測(cè)條件為軌道肼質(zhì)譜儀Thermo fisher Orbitrap Velos

正離子掃描方式，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍375～1 300 m/z，250 ms，MS1resolution 為 60 000，選擇一級(jí)圖譜最高的50個(gè)峰進(jìn)行二級(jí)掃描，掃描范圍375～1 300 m/z，碰撞電壓35 CID（表1）。

表1 色譜梯度

2 結(jié)果

2.1 15N穩(wěn)定同位素最優(yōu)培養(yǎng)基

試驗(yàn)計(jì)劃及結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)表2進(jìn)行方差分析，結(jié)果列見(jiàn)表3；對(duì)表2進(jìn)行因素指標(biāo)分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由表2分析可知，各因素對(duì)副溶血弧菌生長(zhǎng)影響的次序由大到小為葡萄糖（4）＞NH4Cl（2）＞ 乙酸鈉（5）＞ 尿素（3）＞（NH4）2SO4（1）。由表3分析可知，葡萄糖對(duì)副溶血弧菌的產(chǎn)量有極顯著影響，其他因素影響不顯著。由圖1可知，本次正交試驗(yàn)的優(yōu)化配方為（NH4）2SO4（3 g/L）、NH4Cl（2 g/L）和葡萄糖（10 g/L），不添加乙酸鈉和尿素，此條件下的副溶血弧菌產(chǎn)量最高。

15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記的（NH4）2SO4和NH4Cl價(jià)格十分昂貴?？紤]到經(jīng)濟(jì)成本，采用NH4Cl為唯一氮源，濃度為2 g/L，最終副溶血弧菌15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記培養(yǎng)基配方為：NH4Cl（2 g/L）、葡萄糖（10 g/L）、KH2PO4（0.6 g/L）、KH2PO4（0.9 g/L）、MgSO4（0.2 g/L）和NaCl（20 g/L）。配方經(jīng)過(guò)多次重復(fù)增菌試驗(yàn)，產(chǎn)量穩(wěn)定。

2.2 標(biāo)記效率LC-MS/MS驗(yàn)證

副溶血弧菌通過(guò)該標(biāo)記培養(yǎng)基進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，菌細(xì)胞中氮原子置換成穩(wěn)定同位素15N，其中在質(zhì)譜法特別是LC-MS/MS中，驗(yàn)證相對(duì)容易且安全。該方法工藝簡(jiǎn)單合理，培養(yǎng)基組分簡(jiǎn)單，成本低，為工業(yè)化制備15N標(biāo)記副溶血弧菌培養(yǎng)基提供了新的制備方法。

通過(guò)改變流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的比例，優(yōu)化色譜分離條件。在優(yōu)化的LC-MS/MS條件下，最后得到副溶血弧菌ATCC17802 總蛋白的總離子色譜圖（圖2-A）。取1個(gè)15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記蛋白（Lipoic acid amine dehydrogenase）的一個(gè)肽段的一級(jí)色譜圖（圖2-B）。經(jīng)過(guò)分子量計(jì)算驗(yàn)證可以得出結(jié)論：該蛋白中的氮原子由14N置換成穩(wěn)定同位素15N，標(biāo)記效率達(dá)到91.5%。

表2 副溶血弧菌正交試驗(yàn)直觀分析

表3 副溶血弧菌正交試驗(yàn)方差分析

圖1 副溶血弧菌正交試驗(yàn)效應(yīng)曲線

圖2 色譜圖

3 結(jié)論

本文研究了一種15N穩(wěn)定性同位素標(biāo)記副溶血弧菌培養(yǎng)基的制備及其培育方法，所述培養(yǎng)基的配方是：NH4Cl（2 g/L）、葡萄糖（10 g/L）、KH2PO4（0.6 g/L）、KH2PO4（0.9 g/L）、MgSO4（0.2 g/L）、NaCl（20 g/L）、蒸餾水（1 L，pH 7.0～7.5）；氮源的氮原子采用15N進(jìn)行標(biāo)記。培育15N標(biāo)記副溶血弧菌的方法為連續(xù)多次

轉(zhuǎn)接培養(yǎng)副溶血弧菌，LC-MS/MS驗(yàn)證標(biāo)記的副溶血弧菌細(xì)胞中蛋白質(zhì)氮原子的標(biāo)記效率，標(biāo)記效率為91.5%。該工藝簡(jiǎn)單合理，培養(yǎng)基組分簡(jiǎn)單，成本低，為工業(yè)化制備15N標(biāo)記副溶血弧菌培養(yǎng)基提供了新的制備方法。

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